Digital Holographic Microscopy in Partially Coherent Illumination and Applications

In this chapter, we describe several configurations of digital holographic microscopes operating with partially coherent illumination, including the implementation of color holography. The different ways of implementing partially coherent illumination are described and discussed, as well as the respective improvements they provide depending on the properties of the observed objects. Several significant applications in the biomedical and environmental fields are presented. In particular, we carry out researches on correlative quantitative phase-contrast-fluorescence imaging on blood with a special focus on the behavior of platelets in relation to relevant pathologies. In the environmental domain, we demonstrate the use of high-throughput digital holographic microscopy to monitor and analyze plankton and microalgal cultures

Méthodes de microscopie par holographie numérique interférentielle en couleurs avec un éclairage partiellement cohérent

La présente thèse traite de méthodes en microscopie holographique numérique (MHN) en couleurs, avec un éclairage de cohérence spatiale partielle. Le principal inconvénient de la microscopie optique classique est sa faible profondeur de champ, rendant difficile l’observation de phénomènes dynamiques dans des échantillons épais. Au contraire, la MHN offre une reconstruction en profondeur grâce à la propagation numérique de l’hologramme. La MHN interférométrique donne aussi le contraste quantitatif de la phase, utile pour analyser des objets transparents. Un éclairage à plusieurs longueurs d’onde dans une configuration appropriée permet la MHN en couleurs. L’imagerie en flux et en couleurs de particules en MHN est ici développée, avec une méthode pour la correction automatique de la balance des couleurs et des défauts permanents. Elle est appliquée pour l’analyse du plancton dans des échantillons d’eau de surface et fournit des images de haute qualité pour les intensité et phase optiques. En outre, la réduction du bruit obtenue en diminuant la cohérence spatiale de l’éclairage en MHN est également étudiée, avec deux modèles évaluant quantitativement ce phénomène en fonction de la cohérence spatiale de la lumière et de la distance entre la source de bruit et le plan d’enregistrement. De plus, la MHN différentielle est aussi abordée. Celle-ci fournit les phases différentielles, la phase étant calculée par intégration. Cependant, les défauts présents conduisent à des aberrations lors du calcul de la phase, qui affectent sa qualité et empêchent la reconstruction holographique. Un traitement spécifique est développé, permettant la reconstruction numérique en profondeur. Enfin, en MHN, un critère est essentiel pour déterminer automatiquement la distance de netteté de l’objet. Deux critères de netteté sont ici mis au point, fonctionnant indépendamment de la nature de l’objet observé (amplitude, phase ou mixte). L’un, monochromatique, est basé sur l’analyse de l’amplitude et sur un filtrage passe-haut ;l’autre, qui détecte rapidement le plan de netteté en MHN en couleurs, compare la phase dans le domaine de Fourier entre les couleurs. Les méthodes développées dans la thèse montrent le potentiel élevé de la MHN en couleurs avec un éclairage partiellement cohérent spatialement, suggérant un avenir prometteur pour cette technique.The thesis deals with methods and developments in color digital holographic microscopy (DHM), with a partial spatial coherence illumination. The principal drawback of classical optical microscopy is its poor depth of field, which makes difficult the observation of dynamic phenomena in thick samples. On the contrary, DHM provides reconstruction in depth thanks to numeric propagation of the recorded hologram. Another feature of interferometric DHM is the quantitative phase contrast imaging, useful for analyzing transparent objects. Usual DHM is limited to monochromatic case, but multispectral illumination in an appropriate setup leads to color DHM. Color in-flow imaging of particles in DHM is developed in the thesis, with a method for the automatic correction of color balance and permanent defects. It is applied to analyze plankton microorganisms in untreated pond water samples, and provides high quality images, for both optical phase and intensity. Moreover, noise reduction obtained when decreasing the spatial coherence of the illumination in DHM is also investigated in the thesis, with the development of two models that quantitatively assess the noise reduction as a function of both the spatial coherence of the illumination, and the defocus distance of the noise source. Furthermore, differential DHM (DDHM) is also studied in the thesis. As DHM gives the optical phase, DDHM provides differential phases, from which phase is retrieved by integration. However, misalignments and defects give some aberrations, which affect phase quality and hinder refocusing. A specific hologram processing is developed, giving an accurate phase image and enabling holographic reconstruction in depth. Finally, in DHM, a criterion is essential to automatically achieve the refocusing distance of the object. Two refocusing criteria are developed in the thesis, both working independently of the nature of the observed object (amplitude, phase, or both mixed). The first one, monochromatic, is based on amplitude analysis and on a high-pass filtering process. The second one, which gives fast refocusing in multispectral DHM, compares the phase in the Fourier domain among wavelengths. Methods developed in the thesis show the high potential of color DHM with a partial spatial coherence illumination, suggesting a promising future for this technique.Doctorat en Sciences de l'ingénieur et technologieinfo:eu-repo/semantics/nonPublishe

Chimie :science de la matière et de ses transformations

info:eu-repo/semantics/publishe

Microscopie holographique numérique en couleur pour l'imagerie en flux avec correction des défauts permanents et remise au net automatiques

L’imagerie en couleur de particules en flux est réalisée à l’aide d’un microscope holographique numérique. La source polychromatique utilisée est composée de trois diodes électroluminescentes (rouge, verte et bleue) donnant une lumière partiellement cohérente, tant spatialement que temporellement. Les hologrammes en couleur enregistrés fournissent des images quantitatives à la fois d’intensité et de phase pour chacune des trois longueurs d’onde, ce qui est d’intérêt pour l’observation de petits objets colorés, par exemple des organismes du microplancton. L’observation de particules dans des flux, sur une grande profondeur, est possible grâce à la reconstruction holographique. Cependant, afin de déterminer automatiquement dans quel plan la particule est nette, un critère de refocalisation est nécessaire. Un tel critère, adapté à la couleur, est présenté. De plus, une méthode est également développée, permettant de corriger automatiquement la balance des couleurs ainsi que les défauts permanents présents dans le champ de vue, qu’ils soient d’intensité ou de phase. De tels défauts sont inhérents au dispositif expérimental et la méthode de correction proposée permet d’obtenir des images de très bonne qualité. L’analyse en flux de microplancton a été réalisée et l’efficacité des méthodes de correction et de remise au net y est illustrée.info:eu-repo/semantics/publishe

Fast numerical autofocus of multispectral complex fields in digital holographic microscopy with a criterion based on the phase in the Fourier domain

The knowledge of the complex amplitude of optical fields, that is, both quantitative phase and intensity, enables numeric reconstruction along the optical axis. Nonetheless, a criterion is required for autofocusing. This Letter presents a robust and rapid refocusing criterion suitable for color interferometric digital holographic microscopy, and, more generally, for applications where complex amplitude is known for at least two different wavelengths. This criterion uses the phase in the Fourier domain, which is compared among wavelengths. It is applicable whatever the nature of the observed object: opaque, refractive, or both mixed. The method is validated with simulated and experimental holograms.SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Partial coherence effects in digital holographic microscopy (Invited Talk)

info:eu-repo/semantics/publishe

Remise au net automatique en microscopie par holographie numérique polychromatique :méthode rapide basée sur l’analyse de la phase dans le domaine de Fourier

En microscopie par holographie numérique, il est possible de reconstruire une image en profondeur à partir d’un seul hologramme. Ceci permet d’obtenir une image nette des objets situés hors du plan d’enregistrement. Un critère de netteté est toutefois nécessaire pour déterminer automatiquement la distance de reconstruction correspondant à l’image nette. Un tel critère est ici présenté. Il est applicable lorsque l’amplitude complexe du champ optique est connue pour au moins deux longueurs d’onde distinctes, par exemple pour les configurations interférométriques de microscopie holographique numérique en couleur. Ce critère se base sur le calcul de la phase dans le domaine de Fourier, laquelle est comparée entre les différentes longueurs d’onde. Le critère opérant dans le domaine de Fourier, il ne requiert pas la reconstruction systématique en profondeur des hologrammes, ce qui rend la détection du plan de netteté très rapide. De plus, ce critère est efficace et présente le même comportement quelle que soit la nature de l’objet observé :objet d’amplitude, de phase ou un mélange des deux. Outre le développement théorique du critère, des simulations numériques sont réalisées, permettant d’étudier son comportement et de confirmer son efficacité. Le critère est également validé expérimentalement avec la remise au net d’images d’organismes du microplancton provenant de l’analyse d’eaux de surface.info:eu-repo/semantics/publishe

Caractérisation du bruit en fonction de la cohérence spatiale de l’éclairage en microscopie holographique numérique interférométrique

info:eu-repo/semantics/publishe

Refocusing based on amplitude analysis in color digital holographic microscopy

A refocusing criterion adapted to red-green-blue (RGB) digital holographic microscopy is established. It is applicable for both amplitude and phase objects. This color criterion is based on a monochromatic criterion, using the integrated modulus amplitude. Simulated RGB holograms show the value of having color information, even for colorless samples; in addition, the position of the focus plane along the optical axis is determined more accurately. Simulations take into account both the numerical apertures of lenses and noise during the holographic process. We also implement an algorithm exponentially reducing the computation time required for detecting the focus plane. The method is validated on experimental holograms.SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Color imaging-in-flow by digital holographic microscopy with permanent defect and aberration corrections

Color imaging-in-flow of particles is performed using red-green-blue (RGB) digital holographic microscopy (DHM), whose sources are partially coherent. RGB DHM provides intensity and quantitative phase images in the three color channels, which is valuable for observing small objects in numerous fields. In-flow investigation on a large depth of field is made possible by the refocusing capability of DHM and has many potential applications. A method is also developed to automatically correct the color balance and compensate both intensity and phase defects and aberrations, providing high-quality imaging. Experimental results show color in-flow analysis of microplankton and confirm the efficiency of the correction method.SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe