Développement de modèles cellulaires et moléculaires facilitant l'étude des interférences VIH, cellules infectées (application à l'étude de l'effet antiviral des phospholipases A2 secrétées)

La réplication du VIH est principalement régulée par des protéines virales ainsi que par une composante résultant de l'activation cellulaire. Pour contrôler l'expression du VIH, nous avons modifié le génome viral de manière à rendre son expression dépendante de la présence de la doxycycline. Les principaux avantages d'un tel système sont de disposer d'un VIH inductible qui devrait permettre, de pouvoir mimer un état de pseudo-latence virale dans les cellules infectées, de découpler la phase d'infection de la phase de production. Enfin, cette construction génétique pourrait servir de base pour un nouveau vecteur lentiviral à expression régulée. Etude de l'effet des phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) humaines sur la réplication du VIH Les sPLA2 catalysent l'hydrolyse des phospholipides membranaires. Les venins animaux sont très riches en sPLA2. Notre équipe a montré que certaines sPLA2 de venins sont de puissants inhibiteurs de la réplication du VIH. Cet effet antiviral implique un mécanisme spécifique qui bloque l'entrée du virus dans la cellule à un stade très précoce. Plusieurs sPLA2 ont été découvertes chez l'homme. Même si le rôle physiologique de ces sPLA2 humaines est encore mal connu, ces enzymes joueraient un rôle majeur dans la réponse immunitaire innée. Mon travail de thèse a consisté à développer des modèles cellulaires permettant d'étudier l'effet des sPLA2 humaines sur la physiologie cellulaire ainsi que leur effet sur la permissivité des cellules vis-à-vis de l'infection par le VIH. Cette nouvelle approche a permis de mettre en évidence le rôle inhibiteur de la réplication du VIH d'une sPLA2 humaines.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Caractérisation de l'entrée d'un VIH résistant aux phospholipases A2 sécrétées (mécanismes moléculaires et implications physiopathologiques)

Les phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) sont de puissants inhibiteurs de l'entrée du virus de l'immunodéficience humaine (HIV) (Fenard et al., 1999). Afin de mieux comprendre leur mécanisme d'action, nous avons cloné un HIV résistant à la sPLA2 de venin d'abeille (bvPLA2), HIVRBV-3. Mon projet de thèse a consisté en l'élucidation des mécanismes moléculaires qui confèrent sa résistance à HIVRBV-3. Il est bien documenté que le HIV entre dans la cellule par fusion de la membrane virale avec la membrane plasmique. Par ailleurs, il est généralement admis que les HIV pénétrant dans la cellule par la voie endosomale sont dégradés dans les lysosomes et ne sont donc pas infectieux. Nous avons montré, avec trois techniques d'analyses différentes, que la voie d'entrée de HIVRBV-3 est dépendante des endosomes et de leurs moteurs cytosqueletiques. En effet la réplication de HIVRBV-3 est sensible à plusieurs types d'inhibiteurs de l'acidification des endosomes et de la polymérisation des micro-filaments d'actine et ce, dans différents types cellulaires. Nous montrons que ce mécanisme d'entrée original ainsi que la résistance à bvPLA2 sont supportés par la glycoprotéine d'enveloppe (gp160) de HIVRBV-3. Nos recherches en cours consistent à démontrer l'implication de modifications singulières de certaines boucles variables de la gp120 de HIVRBV-3 dans ce mécanisme d'entrée inédit. Les données de la bibliographie indiquent que ces modifications de la gp120 sont retrouvées dans les souches virales isolées chez les patients non progresseurs à long terme. Notre hypothèse actuelle est donc que les sPLA2 humaines pourraient jouer un rôle dans le contrôle de la réplication virale chez ces individus. L'ensemble de nos résultats nous permet de proposer un nouveau mécanisme d'entrée du HIV dans la cellule. Plus encore, nos résultats suggèrent que le HIV pourrait résister à l'effet de certains inhibiteurs en empruntant une voie d'entrée originale dont les caractéristiques moléculaires restent encore à élucider.Secreted phospholipases A2 (sPLA2) are potent inhibitors of Human Immunodeficiency Virus (HIV) replication. In order to gain insights of their antiviral effects we have cloned a bee-venom sPLA2 (bvPLA2) resistant HIV strain, HIVRBV-3. Our goal is to elucidate the molecular mechanisms that confer bvPLA2 resistance to HIVRBV-3. HIV enters cell via fusion of viral and plasma membrane. Furthermore, it is generally admitted that HIV endosomal entry is a dead end route of infection. We show that HIVRBV-3 entry is highly dependent on the molecular mechanisms of endocytosis, particularly those of vesicular trafficking. We were able to show, using three different ways of investigation, that HIVRBV-3 replication in different cell lines is inhibited by lysosomotropic agents, and by drugs that affect the cytoskeleton (actin microfilaments and microtubules) polymerization. We further demonstrate that HIVRBV-3 envelope glycoprotein directs HIVRBV-3 in this particular entry route and that it is sufficient to confer bvPLA2 resistance to a HIV bvPLA2 sensitive strain. We are currently investigating the role played by uncommon mutations in the variable loops of HIVRBV-3 envelope glycoprotein, in directing the HIVRBV-3 entry pathway. These uncommon mutations are also specific of long-term non-progressor HIV strains. This lead us to assess the role played by endogenous human sPLA2 in the physiopathology of the HIV infection. Altogether our results suggest a new resistance mechanism at the cellular level. Indeed, HIV may overcome the inhibitory effect of an intracytoplasmic block by using an alternative entry pathway.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Human let-7 stem–loop precursors harbor features of RNase III cleavage products

The bidentate RNase III Dicer cleaves microRNA precursors to generate the 21–23 nt long mature RNAs. These precursors are 60–80 nt long, they fold into a characteristic stem–loop structure and they are generated by an unknown mechanism. To gain insights into the biogenesis of microRNAs, we have characterized the precise 5′ and 3′ ends of the let-7 precursors in human cells. We show that they harbor a 5′-phosphate and a 3′-OH and that, remarkably, they contain a 1–4 nt 3′ overhang. These features are characteristic of RNase III cleavage products. Since these precursors are present in both the nucleus and the cytoplasm of human cells, our results suggest that they are generated in the nucleus by the nuclear RNase III. Additionally, these precursors fit the minihelix export motif and are thus likely exported by this pathway

Detection of Epstein–Barr Virus in Periodontitis: A Review of Methodological Approaches

Periodontitis, an inflammatory condition that affects the structures surrounding the tooth eventually leading to tooth loss, is one of the two biggest threats to oral health. Beyond oral health, it is associated with systemic diseases and even with cancer risk. Obviously, periodontitis represents a major global health problem with significant social and economic impact. Recently, a new paradigm was proposed in the etiopathogenesis of periodontitis involving a herpesviral–bacterial combination to promote long-term chronic inflammatory disease. Periodontitis as a risk factor for other systemic diseases can also be better explained based on viral–bacterial etiology. Significant efforts have brought numerous advances in revealing the links between periodontitis and Epstein–Barr virus (EBV), a gamma herpesvirus ubiquitous in the adult human population. The strong evidence from these studies may contribute to the advancement of periodontitis research and the ultimate control of the disease. Advancing the periodontitis research will require implementing suitable methods to establish EBV involvement in periodontitis. This review evaluates and summarizes the existing methods that allow the detection and diagnosis of EBV in periodontitis (also applicable in a more general way to other EBV-related diseases), and discusses the feasibility of the application of innovative emerging technologies

Regulation of Adipose Progenitor Cell Expansion in a Novel Micro-Physiological Model of Human Adipose Tissue Mimicking Fibrotic and Pro-Inflammatory Microenvironments

The expansion of adipose progenitor cells (APCs) plays an important role in the regeneration of the adipose tissue in physiological and pathological situations. The major role of CD26-expressing APCs in the generation of adipocytes has recently been highlighted, revealing that the CD26 APC subtype displays features of multipotent stem cells, giving rise to CD54- and CD142-expressing preadipocytes. However, a relevant human in vitro model to explore the regulation of the APC subpopulation expansion in lean and obese adipose tissue microenvironments is still lacking. In this work, we describe a novel adipose tissue model, named ExAdEx, that can be obtained from cosmetic surgery wastes. ExAdEx products are adipose tissue units maintaining the characteristics and organization of adipose tissue as it presents in vivo. The model was viable and metabolically active for up to two months and could adopt a pathological-like phenotype. The results revealed that inflammatory and fibrotic microenvironments differentially regulated the expansion of the CD26 APC subpopulation and its CD54 and CD142 APC progenies. The approach used significantly improves the method of generating adipose tissue models, and ExAdEx constitutes a relevant model that could be used to identify pathways promoting the expansion of APCs in physiological and pathological microenvironments

Dynamic in vitro cell culture model to study pathogenic interactions in periodontitis in flow using a Lab-on-a-Disc platform

Periodontitis is one of the most common chronic inflammatory diseases worldwide [1]. Recently, the overgrowth of human herpes viruses (HHVs), including herpes simplex virus type 1 (HSV-1), has been suggested as a possible trigger for oral dysbiosis resulting in the progression of periodontitis [2]. Thus, there is a demand for in vitro platforms to facilitate studies of the interactions between oral cells (e.g. epithelial cells and fibroblasts) and HHVs in conditions mimicking the oral cavity to enable a better understanding of fundamental biological processes and evaluate new treatment strategies. Traditionally, viral infections are studied in cells cultured in static conditions, e.g. well plates. However, different methods to study cells in perfusion have received increasing attention [3, 4, 5].A recently established methodology to study cell growth under perfusion in vitro is based on the Lab-on-a-Disc (LoD) [6] technology. LoD is a disc-shaped microfluidic platform the size of a DVD, where centrifugal forces are used to manipulate fluids through channels and chambers [6]. Compared to conventional perfusion systems, LoD platforms are advantageous since there are no external pumps, valves or tubings. In this work, we aim to establish a physiologically relevant LoD model to study dynamic interactions between cells isolated from the oral cavity, e.g. periodontal ligament (PDL) cells, and HHVs as it may occur in periodontitis