Wolfram-Acetylene-Hydratase aus Pelobacter acetylenicus und Molybdän-Transhydroxylase aus Pelobacter acidigallici. Zwei ungewöhnliche Enzyme mit Molybdopterin und Eisen-Schwefel-Cofaktoren

Acetylen Hydratase (AH) aus Pelobacter acetylenicus:P. acetylenicus ist ein mesophiles, strikt anaerob lebendes Bakterium, das in der Lage ist, auf Acetylen als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen. Die Metabolisierung von Acetylen wird durch das W/Fe-S-abhängige Enzym AH eingeleitet.AH wurde zur Homogenität gereinigt. Es handelt sich um ein Monomer mit einer molekularen Masse von 81,9kDa. AH ist ein thermostabiles Enzym, dessen Temperaturoptimum bei 50°C liegt und in einer Stickstoff/Wasserstoff-Atmosphäre bei 6°C über 3 Monate ohne Aktivitätsverlust gelagert werden konnte. Obwohl die AH keine Redox-Reaktion katalysiert, enthält sie ein [4Fe-4S] Zentrum sowie einen W-bisMGD Kofaktor. Mittels ICP/MS, EPR und UV/Vis wurde gezeigt, dass sowohl W als auch Mo in den bisMGD Kofaktor eingebaut werden kann. Eine V-abhängige AH konnte nicht erhalten werden. Kristalle der AH streuten bis zu Auflösungen unter 2,5Å.Transhydroxylase (TH) aus Pelobacter acidigallici:P. acidigallici ist ein strikt anaerob lebendes Bakterium, das z.B. auf Gallussäure oder Pyrogallol leben kann. Ein entscheidender Schritt des Gallussäure-Metabolismus ist die Transhydroxylierung von Pyrogallol zu Phloroglucin, die von dem Mo/Fe-S-abhängigen Enzym TH katalysiert wird.Mittels eines neuen Reinigungsverfahrens wurde TH zur Homogenität gereinigt, wobei die spezifische Aktivität um etwa 50 gesteigert wurde. Es handelt sich um ein Heterodimer aus einer 100,4kDa- und 31,3kDa-Untereinheit. Obwohl die Gesamtreaktion der TH keine Redoxreaktion ist, enthält das Enzym einen Mo-bisMGD-Redoxkofaktor und verschiedene Fe/S-Zentren. Im EPR-Spektrum des 'as isolated'-Enzyms erkennt man ein Mo(V)-Zentrum, beim reduzierten Enzym die Signale verschiedener [4Fe-4S] Zentren. Im UV/Vis-Spektrum erkennt man die Absorptionsschulter der Fe/S-Zentren sowie von S/Mo-Ladungstransfer-Übergängen. Kristalle der TH streuten bis zu Auflösungen unter 2,5Å.Beide Enzyme gehören zur Familie der DMSO-Reduktasen

Nitrite reductase from sulfate-reducing bacteria: Purification, biochemical and spectroscopic properties

Nitritreduktasen sind Schlüsselenzyme im biogeochemischen Stickstoffkreislauf und katalysieren die sechs-Elektronen-Reduktion von Nitrit zu Ammoniak innerhalb des Stoffwechselwegs der dissimilatorischen Nitratreduktion zu Ammoniak. Ziel dieser Arbeit war es, die Cytochrom c Nitritreduktase des sulfatreduzierenden Bakteriums Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774) zu reinigen sowie biochemisch und spektroskopisch zu charakterisieren. Hierzu wurde D. desulfuricans mit Nitrit als terminalem Elektronenakzeptor und DL-Lactat als Elektronendonor kultiviert. Die membranständige Cytochrom c Nitritreduktase wurde in drei chromatographischen Schritten zur Homogenität gereinigt. Das Enzym ist ein Heterodimer mit einer molekularen Masse von 60,4 kDa der großen Untereinheit und von 17,5 kDa der kleinen Untereinheit. Das Elektronenanregungsspektrum zeigt Signale die charakteristisch für c-Typ Cytochrome sind. Im EPR Spektrum erkennt man Signale von low-spin Häm-Fe(III) Zentren. Durch Edmanabbau wurden die ersten sieben Aminosäuren des aminoterminalen Endes der Aminosäuresequenz der Nitritreduktase ermittelt

Crystal structure of pyrogallol phloroglucinoltranshydroxylase, an Mo enzyme capable ofintermolecular hydroxyl transfer between phenols

The Mo enzyme transhydroxylase from the anaerobic microorganism Pelobacter acidigallici catalyzes the conversion of pyrogallol to phloroglucinol. Such trihydroxybenzenes and their derivatives represent important building blocks of plant polymers. None of the transferred hydroxyl groups originates from water during transhydroxylation; instead a cosubstrate, such as 1,2,3,5-tetrahydroxybenzene, is used in a reaction without apparent electron transfer. Here, we report on the crystal structure of the enzyme in the reduced Mo(IV) state, which we solved by single anomalousdiffraction technique. It represents the largest structure (1,149 amino acid residues per molecule, 12 independent molecules per unit cell), which has been solved so far by single anomalousdiffraction technique. Tranhydroxylase is a heterodimer, with the active Mo molybdopterin guanine dinucleotide (MGD)2 site in the α-subunit, and three [4FeO4S] centers in the β-subunit. The latter subunit carries a seven-stranded, mainly antiparallel β-barrel domain. We propose a scheme for the transhydroxylation reaction based on 3D structures of complexes of the enzyme with various polyphenols serving either as substrate or inhibitor

Crystallization and preliminary X-ray analysis of the molybdenum-dependent pyrogallol-phloroglucinol transhydroxylase of Pelobacter acidigallici

Crystals of the molybdo-/iron±sulfur protein pyrogallol:phloroglucinol hydroxyltransferase (transhydroxylase; EC 1.97.1.2) from Pelobacter acidigallici were grown by vapour diffusion in an N2/H2 atmosphere using polyethylene glycol as a precipitant. In this microorganism, transhydroxylase converts pyrogallol to phloroglucinol in a unique reaction without oxygen transfer from water.Growth of crystals suitable for X-ray analysis was strongly dependent on the presence of dithionite as a reducing agent. The crystals belonged to space group P1 and MAD data were collected on the iron K edge to resolutions higher than 2.5

Crystallization and preliminary X-ray analysis of the tungsten-dependent acetylene hydratase from Pelobacter acetylenicus

Acetylene hydratase, a tungsten-containing hydroxylase that converts acetylene to acetaldehyde, has been purified and crystallized under anaerobic conditions

Crystallization and preliminary X-ray analysis of the tungsten-dependent acetylene hydratase fromPelobacter acetylenicus

Acetylene hydratase is a tungsten-containing hydroxylase that converts acetylene to acetaldehyde in a unique reaction that requires a strong reductant. The subsequent disproportionation of acetaldehyde yields acetate and ethanol. Crystals of the tungsten/iron-sulfur protein acetylene hydratase from Pelobacter acetylenicus strain WoAcy 1 (DSM 3246) were grown by the vapour-diffusion method in an N2/H2 atmosphere using polyethylene glycol as precipitant. Growth of crystals suitable for X-ray analysis strictly depended on the presence of TiIII citrate or dithionite as reducing agents