Biological characterisation of natural products and derivatives in special consideration of high-content analysis methods

Viele Naturstoffe sind biologisch aktiv und finden in der Medizin und/oder als Hilfsmittel in der Forschung Verwendung. Dafür ist es essentiell, sie biologisch zu charakterisieren. In dieser Arbeit wurden verschiedene Naturstoffe und Naturstoffderivate auf ihre biologischen Wirkungen hin untersucht. Dazu gehörten unterschiedliche Tetramsäuren, Iridoide aus Pflanzen und von Myxobakterien produzierte Substanzen, die zunächst bezüglich ihrer wachstumshemmenden Wirkung an mehreren Säugerzelllinien und Mikroorganismen untersucht wurden. In einigen Fällen wurden weitere Untersuchungen wie Fluoreszenzfärbungen, Tests zur Actin-Polymerisation oder Zellzyklusanalysen durchgeführt. Als neuartige Methode zur Evaluierung von biologischen Wirkmechanismen konnte in der vorliegenden Arbeit erfolgreich eine High-Content Analyse (HCA) etabliert werden. Bei dieser HCA wurden phänotypische Veränderungen von Zellen, die durch die biologisch aktiven Substanzen hervorgerufen werden, über automatisierte Mikroskopie und softwaregestützte Bildanalyse quantifiziert. Mithilfe verschiedener statistischer Methoden konnten die phänotypischen Profile neuer Verbindungen mit den Profilen von Substanzen mit bekannter Wirkung verglichen werden, um so Hinweise auf den Wirkmechanismus der neuen Verbindung zu gewinnen. Zu den für die HCA optimierten Parametern gehörten die Auswahl und Konzentrationsbestimmungen der Referenzsubstanzen sowie geeigneter Antikörper/Farbstoffe und die Optimierungen praktischer Abläufe. Es wurden verschiedene statistische Analysemethoden evaluiert und die Funktionalität der HCA an zahlreichen Beispielen gezeigt. Mit der HCA steht ein neues Werkzeug bereit, um in Zukunft einzelne Verbindungen oder auch Substanzbanken charakterisieren zu können.Numerous natural products are biologically active and thus are used as drugs and/or as tools in research. Therefore deeper knowledge about their mode of action is essential. Diverse natural products or derivatives thereof have been biologically characterised for this thesis. These substances comprise various tetramic acids, iridoids from plants, and myxobacterial compounds. First, their anti-proliferative activity has been determined, using several mammalian cell lines as well as microorganisms. In some cases further examinations have been performed, including immunofluorescence, determination of actin polymerisation, and cell cycle analyses. High-content analysis (HCA) is a new strategy that could be utilised to gain further insight into the mode of action of small molecules. Such a method was successfully established as presented in this thesis. The HCA is based on phenotypic changes in cells that are induced by the biologically active compounds. These changes are measured and quantified using automated microscopy and appropriate image-analysis tools. By means of different statistical methods, compounds with an already known mode of action can be compared to the new entities, revealing information about the mode of action of the latter. In order to establish the HCA several parameters had to be ascertained. A set of reference compounds and appropriate antibodies/probes have been chosen and their concentrations have been determined. The optimisation also included numerous experimental steps. Different statistical methods have been compared and the efficacy/functionality of the HCA was demonstrated. The HCA is now available as a useful tool to characterise single substances or compound libraries