Optimization of the fermentation process

Biosynthesis of noncoding RNAs (ncRNAs) in microorganisms has stood out as a cost-effective and favourable method for natural RNA production, and Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum), a marine phototrophic bacterium, has been studied as a potential host for this bioprocess. Then, this work intends to optimize, in a mini bioreactor platform, the fermentation process of R. sulfidophilum strain DSM 1374 as a recombinant host to produce ncRNAs. So, the effect of the inoculum size, temperature and oxygen availability was studied, and the best outcome was achieved in fermentations at 30 ºC with 18% inoculum where fully aerobic-dark conditions are provided. Under such conditions the effects of the main carbon source were analysed in which glucose (Si = 10 g/L) was replaced by glycerol in R. sulfidophilum fermentation. Glycerol metabolization was analysed when using differents initial concentrations (Si = 20, 10, 5, and 2.5 g/L) and the consumption of both the carbon sources was assessed by HPLC-RID. Briefly, the optimized conditions in bioreactor scale yielded 1.8 times more biomass when glycerol (Si = 10 g/L) was the main carbon source, and 2.3 times more biomass compared to the optimized conditions in shake flask scale. Both carbon source lead to a maximum of total RNA production at 60 h, being of 537 ± 49 µg/mL in glucose and 446 ± 58 µg/mL in glycerol. Noteworthy, the electrophoretic qualitative analysis of small ncRNAs biosynthesis demonstrated a higher concentration also at 60 h in both glucose and glycerol fermentation. The results from the batch fermentations suggest a more efficient utilization of glycerol by R. sulfidophilum which reflects in higher biomass and reasonably higher ncRNA productivity. With a view of increasing the overall biomass and productivity, fed-batch experiments were carried out through constant glycerol feed. The results proved that a feed solution containing only glycerol does not lead to biomass increasing, as is expected, highlighting the interaction of different growth limiting factors. All these results together leave an open door for the study of glycerol as a substrate for recombinant biosynthesis of ncRNAs in R. sulfidophilum, specifically for the development of new feed strategies adequate to the nutritional requirements of the bacteria and that allow increasing the biomass and the productivity of ncRNAs.Durante um longo período de tempo, a contribuição dos ácidos ribonucleicos (RNAs) nas funções celulares foram amplamente subvalorizadas, limitando-se a serem descritos como intermediários no processo celular em que uma sequência de ácido desoxirribonucleico (DNA) codifica uma proteína. A investigação em torno destas moléculas, contudo, permitiu identificar pequenas moléculas de RNA não codificantes (ncRNA) que participam em funções celulares regulatórias. Em muitos casos, a expressão diferencial destes RNAs é reconhecida como hallmark de muitas patologias humanas incluindo vários cancros, as doenças neurodegenerativas, as doenças cardiovasculares e a diabetes. Assim, assumem-se como potenciais biomarcadores para diagnóstico e prognóstico, mas também como novos alvos e agentes terapêuticos. O uso de RNAs para fins clínicos tem exigido à comunidade científica uma investigação centrada nestas moléculas por forma a decifrar corretamente a sua estrutura, função e interações. Assim, a necessidade de aceder a grandes quantidades de RNA aumentou e levou à procura de novos métodos para a produção de RNA. A combinação da tecnologia de DNA recombinante e de processos de fermentação de microrganismos, já amplamente utilizada para a produção recombinante de proteínas, tem-se mostrado adequada para a biossíntese de RNA em quantidades que, dificilmente, seriam obtidas por outras metodologias de forma sustentável. Um dos principais objetivos deste método é desenvolver estratégias para expressar o produto alvo de forma mais eficiente, ou seja, maior produtividade a menor custo. Para tal, a indústria biotecnológica tem apostado em fermentações de elevada densidade celular cujo sucesso assenta na otimização do bioprocesso. Inúmeros fatores devem ser considerados incluindo o organismo hospedeiro, as condições de fermentação, mas também as estratégias para maximizar seu crescimento e produção. A Rhodovulum sulfidophilum (R. sulfidophilum), bactéria marinha fototrófica facultativa, tem-se mostrado um potencial hospedeiro para a biossíntese recombinante de pequenos RNAs regulatórios, em parte, graças ao baixo nível, intracelular e extracelular, de RNAses que permitem manter a integridade dos RNAs recombinantes. Ao longo dos anos, poucos estudos têm sido levados a cabo com o propósito de maximizar o crescimento deste hospedeiro, deixando-a pouco apelativa para a indústria biotecnológica quando comparada com a Escherichia coli, cujas estratégias de crescimento já se encontram claramente definidas. Assim o objetivo da dissertação apresentada, centra-se em aumentar a densidade celular das fermentações de R. sulfidophilum e consequentemente incrementar a produtividade de ncRNAs. Para tal, foram realizadas fermentações batch em mini-bioreatores, nas quais o efeito do tamanho do inóculo, da disponibilidade de oxigénio e da temperatura foram estudadas, tendo como referência valores aplicados em fermentações em erlenmeyers. Além disso, tendo em consideração o impacto que a fonte de carbono pode ter na formação de biomassa, a glucose e o glicerol foram comparados em diferentes outputs deste bioprocesso. Relativamente ao inóculo, foram testados quatro tamanhos diferentes (13%, 18%, 24% e 30%) o que permitiu estabelecer 18% como o tamanho de inóculo mais adequado às fermentações em bioreator devido aos maiores níveis de biomassa alcançados. Foram, igualmente, testadas temperaturas diferentes para as fermentações, 25, 30 e 37 ºC, e avaliada a sua influência no perfil de crescimento. A temperatura que favoreceu a obtenção de níveis de biomassa mais elevados foi a de 30 ºC sendo, por isso, selecionada como temperatura ótima para as fermentações de R. sulfidophilum em bioreator. A glucose (10 g/L) e o glicerol (20, 10, 5 e 2,5 g/L) foram testados como fonte principal de carbono nas fermentações em bioreator e suas concentrações no meio extracelular foram quantificadas ao longo do tempo por HPLC acoplado com um detetor por índice de refração. Ambas as fontes de carbono, apresentaram um perfil de consumo semelhante, onde começaram a ser efetivamente metabolizados pela bactéria após 40 h de fermentação. Contudo a utilização de glicerol como principal fonte de carbono resultou num aumento considerável de biomassa final (5,94 g/L) quando comparado com a glucose (3,30 g/L). Em termos do produto alvo, foi estudada quantitativamente a produção de RNA total e qualitativamente a produção de ncRNAs. A produção de RNA total, em amostras normalizadas pela massa de células obtida, foi analisada ao longo do tempo, evidenciando-se, para ambas, um pico de produção às 60 horas de fermentação correspondendo a 537 ± 49 µg/mL para a glucose e 446 ± 58 µg/mL para o glicerol. Paralelamente, a análise qualitativa da expressão de ncRNAs demostrou um pico de produção às 60 h para as duas fontes de carbono, sugerindo que a produção recombinante de RNA em R. sulfidophilum acompanha o perfil de produção de RNAs homólogos. Considerando todos os resultados obtidos, é possível concluir que a substituição da glucose por glicerol para a produção recombinante de ncRNAs em R. sulfidophilum em fermentações batch à temperatura de 30 ºC e com 18 % de inóculo é promissora, uma vez que resultou numa maior produção volumétrica graças ao simples incremento da biomassa. Os resultados em batch deixam uma porta aberta para o estudo de novas estratégias de fermentações (fed-batch) e para otimização das fermentações recorrendo a design experimental no qual os ensaios são planeados estrategicamente analisando o efeito sinergético de inputs alvos, para se obter maior informação sobre o efeito de mais do que um parâmetro na produtividade do biotarget