Differential expression of CDC25 phosphatases splice variants in human breast cancer cells

Background: CDC25 phosphatases control cell cycle progression by activating cyclin dependent kinases. The three CDC25 isoforms encoding genes are submitted to alternative splicing events which generate at least two variants for CDC25A and five for both CDC25B and CDC25C. An over-expression of CDC25 was reported in several types of cancer, including breast cancer, and is often associated with a poor prognosis. Nevertheless, most of the previous studies did not address the expression of CDC25 splice variants. Here, we evaluated CDC25 spliced transcripts expression in anti-cancerous drug-sensitive and resistant breast cancer cell lines in order to identify potential breast cancer biomarkers. Methods: CDC25 splice variants mRNA levels were evaluated by semi-quantitative RT-PCR and by an original real-time RT-PCR assay. Results: CDC25 spliced transcripts are differentially expres-sed in the breast cancer cell lines studied. An up-regulation of CDC25A2 variant and an increase of the CDC25C5/C1 ratio are associated to the multidrug-resistance in VCREMS and DOXOR breast cancer cells, compared to their sensitive counterpart cell line MCF-7. Additionally, CDC25B2 tran-script is exclusively over-expressed in VCREMS resistant cells and could therefore be involved in the development of certain type of drug resistance. Conclusions: CDC25 splice variants could represent interesting potential breast cancer prognostic biomarkers

Evaluation biologique de l'inhibition des phosphatases CDC25 dans des lignées d'adenocarcinomes mammaires humains

Les phosphatases CDC25 sont des enzymes clés qui interviennent dans la progression du cycle cellulaire en régulant l activité des kinases dépendantes des cyclines (Cdk) par déphosphorylation. Ces phosphatases sont des cibles thérapeutiques intéressantes car leur surexpression, notamment dans le cancer du sein, a pu être corrélée au développement de résistance à certains agents anticancéreux ainsi qu à un mauvais pronostic.Ce projet vise à évaluer le système des phosphatases CDC25 en tant que cibles intéressantes dans le traitement du cancer du sein.Lors de cette étude, nous nous sommes intéressés à deux composés organosoufrés naturellement présents dans l ail et l oignon, les diallyl- (DAS4) et dipropyl- (DPS4) tétrasulfures. Nous avons montré que ces composés étaient capables d inhiber, de manière irréversible, les phosphatases CDC25A et C in vitro. Le potentiel anticancéreux des composés DAS4 et DPS4 a été confirmé sur des cellules d adénocarcinome mammaire humain : MCF-7 et MDA-MB-231 (lignées sensibles) et Vcr-R (lignée résistante). Leur croissance est apparue significativement altérée par ces deux composés qui a pu être associée à un blocage du cycle cellulaire en phase G2/M. Par ailleurs, nos résultats ont également suggéré l existence d une activité pro-apoptotique des composés DAS4 et DPS4 qui est indépendante de la production d espèces réactives oxygénées. L étude de l induction de l apoptose dans le cas des cellules MCF-7 a révélé l implication des protéines de la famille Bcl-2.Ces résultats suggèrent que l inhibition des phosphatases CDC25A et C serait un des mécanismes qui contribuerait à l activité anticancéreuse des composés organosoufrés.The CDC25 phosphatases are important regulators of eukaryotic cell cycle progression and play a crucial role in the activation of cyclin-dependent kinases (Cdk) by dephosphorylation. CDC25s are attractive targets in cancer therapy because their over-expression was reported in various types of human malignancies, including breast cancer, and this has been correlated with either poor prognosis or tumor aggressiveness.Our study aims to evaluate the CDC25s as interesting targets in breast cancer treatment. This study reports the inhibitory activity of two tetrasulfides : diallyl- (DAS4) and dipropyl- (DPS4) tetrasulfides naturally occurring in garlic and onion, towards the human cell division cycle (CDC) 25 phosphatases. Both compounds have emerged as interesting irreversible inhibitors of the CDC25 isoforms A and C in vitro.Then, we have investigated the anticancer properties of DAS4 et DPS4 on both sensitive (MCF-7 and MDA-MB-231) and resistant (Vcr-R) human breast carcinoma cell lines. Experiments performed on cultured cells have showed that growth of both sensitive and resistant cells was significantly decreased by these tetrasulfides and appeared to be associated with a G2/M cell cycle arrest. In addition, our results also suggested that DAS4 and DPS4 induce apoptotis in MCF-7 cells without affecting reactive oxygen species production. Analysis of mechanisms implicated in apoptosis induction in MCF-7 cells after treatment with DAS4 et DPS4 have suggested the involvement of the Bcl-2 family members. Taken together, these results suggest phosphatases CDC25A and C as possible targets of naturally occuring polysulfides contributing to their anticancer properties.METZ-SCD (574632105) / SudocSudocFranceF

Mécanismes de transport du glutathion : caractérisation et intervention lors de l'apoptose

[Résumé en français] L'objectif de ce travail est d'étudier d'une part le transport in vitro du glutathion au sein du réticulum endoplasmique (pancréas de porc et foie de rat) et d'autre part, le transport de ce tripeptide dans les cellules MCF-7 et apparentées, dérivant d'adénocarcinomes mammaires humains lorsque celles-ci sont soumises à des traitements pro-apoptotiques. L'intervention de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 dans ce dernier processus a notamment été évaluée. Une méthode d'ultratiltration rapide a été choisie pour mesurer les activités de transport du tripeptide microsomal. Le glutathion a été quantifié par chromatographie liquide haute performance. Dans la première partie de notre travail, nous avons observé un influx préférentiel du glutathion réduit (OSH) uniquement dans les microsomes de RER, ainsi qu'un efflux de OSH ralenti par des inhibiteurs de transporteurs anioniques. L'existence d'un mécanisme de transport du OSH pouvant faire intervenir le translocon au sein du réticulum endoplasmique est proposé. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons montré que la sur-expression de Bcl-2 dans les cellules MCF -7 favorise la résistance aux anti-cancéreux cisplatine et adriamycine en maintenant le niveau de GSH intracellulaire par une inhibition de l'efflux précoce de GSH. Ceci a permis de préciser le rôle anti-oxydant de Bcl-2 au sein de la cellule.[Résumé en anglais] Our thesis work aims to study (1) the in vitro transport of glutathione in the endoplasmic reticulum (pig pancreas and rat liver) and (2) the transport of this tripeptide in MCF-7 and related cells from human mammary adenocarcinoma, when these cells are submitted to proapoptotic treatments. The intervention of the anti-apoptotic Bcl-2 protein in this last process has been evaluated. Rapid uItrafiltration was chosen to measure the transport activities of the microsomal tripeptide. Glutathione was quantified by high performance liquid chromatography. ln the first part of our work, we have observed a preferential uptake of reduced glutathione (GSH) only in RER microsomes, and a slow GSH efflux inhibited by anionic transporters inhibitors. The existence of a GSH transport mechanism involving the translocon in the \ endoplasmic reticulum is proposed. ln the second part of our work, we have shown that th~ overexpression of Bcl-2 in MCF-7 cells promotes cisplatin and adriamycine resistance by maintaining intracellular GSH level by an inhibition of GSH steady-state efflux. This work provides further insight into the anti-oxidant role ofBcl-2 in cells.NANCY1-SCD Medecine (545472101) / SudocSudocFranceF

Implication du système thiorédoxine dans la régulation des phosphatases CDC25 dans des cellules de cancer du sein en condition de stress oxydant

De récentes études suggèrent que la régulation des phosphatases par le peroxyde d hydrogène pourrait jouer un rôle important dans la signalisation cellulaire. Dans les cellules cancéreuses qui possèdent un statut redox souvent pro-oxydant, ce mécanisme de régulation pourrait être crucial pour la prolifération tumorale. Les phosphatases CDC25 (A, B et C) sont des régulateurs de la progression du cycle cellulaire. Sohn et Rudolph ont montré que les CDC25B et C peuvent être inactivées par le peroxyde d hydrogène et réactivées en présence du système thiorédoxine/thiorédoxine réductase (trx/trxR), in vitro. L existence d une telle régulation dans des cellules cancéreuses pourrait ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques puisqu une inhibition des trxR ou des trx pourrait induire une inhibition des CDC25 et ainsi prévenir la croissance tumorale. Après avoir vérifié que CDC25A était également sensible au peroxyde d hydrogène et réactivable in vitro par le système trx/trxR, les effets du peroxyde d hydrogène et de deux inhibiteurs du système trx/trxR, l Auranofine et l Acroléine, ont été testés sur des lignées d adénocarcinome mammaire humain (MCF7 et MDA-MB 231). Ces deux lignées présentent des niveaux d expression variables pour la trx1. Dans les deux types de cellules, H2O2 induit un arrêt du cycle cellulaire malgré l absence d inhibition totale des CDC25. La conservation de l état de phosphorylation des CDK lors de ce traitement témoigne donc de l existence d un système protecteur efficace pour ces phosphatases. L inhibition totale des trxR par l Auranofine engendre des effets cytotoxiques et une production de peroxydes dans les deux lignées. Il en est de même pour les cellules MDA-MB 231 traitées par l Acroléine alors que les cellules MCF7 sont totalement résistantes à cette molécule. Le traitement des cellules par l Auranofine induit un stress oxydant modéré car il n altère pas le taux intracellulaire de glutathion, n induit pas d oxydation des trx1 et ne modifie pas la répartition des cellules dans le cycle cellulaire. Toutefois, ce traitement induit des cassures de l ADN qui peuvent expliquer la cytotoxicité de ce composé. L acroléine au contraire provoque, dans les cellules MDA-MB 231, une importante déplétion en glutathion associé à une oxydation majeure des trx1 et à un arrêt du cycle cellulaire. Ce dernier ne semble toutefois pas dû à une hyper-phosphorylation des CDK, ce qui suggère qu une altération complète du système trx/trxR n induit pas une inhibition totale des CDC25. Afin d apporter des éléments nouveaux pour la compréhension des mécanismes de régulation redox des CDC25 et du cycle cellulaire dans les cellules de cancer du sein, nous avons ensuite étudié les impacts d une surexpression de la Mn-SOD dans les cellules MCF7 puisque ces dernières sous-expriment cette protéine par rapport aux cellules MDA-MB 231. Les résultats obtenus révèlent que la répartition des cellules dans le cycle cellulaire et la phosphorylation des CDK ne sont pas sensibles à ce changement d expression. Dans ce travail nous avons donc pu mettre en évidence que le rôle des CDC25 dans la régulation du cycle cellulaire n est pas dépendant de l état de fonctionnalité du système trx/trxR ou du niveau d expression des Mn-SOD mais qu il existe un système protecteur puissant qui permet de maintenir au moins en partie l activité de déphosphorylation des CDC25 en milieu pro-oxydant dans les cellules de cancer du seinRecent studies suggest that the regulation of phosphatases by hydrogen peroxide may play an important role in cell signaling. In cancer cells, which often possess a pro-oxidative redox state, this regulation could be essential for tumor growth. CDC25 phosphatases (A, B and C) are key regulators of cell cycle progression. Sohn and Rudolph have shown that CDC25B and C are inactivated by hydrogen peroxide and reactivated by the thioredoxin/thioredoxin reductase system (trx/trxR), in vitro. Such regulation in cancer cells could open new therapeutic avenues since the inhibition of trxR or trx could induce a CDC25 inhibition and so prevent tumor cell multiplication. After verifying that CDC25 activity is sensitive to H202 and could be restored by trx/trxR system in vitro, the effects of hydrogen peroxide and that of two trx/trxR inhibitors (Auranofin and Acrolein) was tested on human breast adenocarcinoma cells (MCF7 and MDA-MB 231). These two cell lines exhibit differential expression level for trx1. In both cell lines, H202 could induce a cell cycle arrest in spite of the lack of a full CDC25 inhibition. The maintenance of the CDK phosphorylation state suggests that an efficient protective system exists for these phosphatases. The total inhibition of trxR by Auranofin led to cytotoxic effects and peroxide production in both cell lines. Similar results were obtained for MDA-MB 231 cells treated with Acrolein while MCF7 cells were found to be resistant to this compound. Auranofin could trigger a moderate oxidative stress in treated cells without affecting intracellular GSH content, trx1 oxidation and cell cycle distribution. However, this treatment could trigger double-strand DNA breaks, which could explain the cytotoxicity of Auranofin. Conversely, Acrolein could provoke a strong GSH depletion associated with a full oxidation of trx1 and a cell cycle arrest in MDA-MB 231 cells. Nevertheless, this cell cycle disruption was not due to CDK hyper-phosphorylation, suggesting that a total inhibition of the trx/trxR system does not trigger a full CDC25 inhibition. Furthermore, in order to bring additional knowledge about CDC25 and cell cycle oxidative regulation in breast cancer cells, we have studied the effects of the Mn-SOD over-expression in MCF7 cells. In this cell line, Mn-SOD expression level was found to be lower than in MDA-MB 231 cells. Our results showed that the cell cycle distribution and CDK phosphorylation are not affected by Mn-SOD over-expression. In conclusion, we have shown in this work that the CDC25 function in cell cycle regulation is independent of both a functional trx/trxR system and Mn-SOD expression level but that, under pro-oxidative conditions, a potent protective system maintains at least partially CDC25 dephosphorylation activity in breast cancer cellsMETZ-SCD (574632105) / SudocSudocFranceF

Evaluation du potentiel inhibiteur de molécules nouvelles vis-à-vis des Cdc25 et du cycle cellulaire sur des lignées MCF7 sensibles et résistantes

Dans les cellules de mammifères, trois phosphatases Cdc25 (A, B et C) contribuent au contrôle de la prolifération cellulaire en régulant positivement les complexes cycline/Cdk qui assurent la progression des cellules dans leur cycle. A ce titre, ces protéines régulatrices du cycle cellulaire constituent une cible thérapeutique attractive en cancérologie. Nous avons tout d abord caractérisé les effets d analogues de kenpaullone, inhibiteurs de Cdk, dans deux lignées d adénocarcinome mammaire, l une sensible (MCF7), l autre, issue de MCF7, mais résistante (Vcr-R). L un de ces analogues bromo-substitué, peu actif sur les cellules résistantes, a montré clairement chez MCF7 une activité antiproliférative et pro-apoptotique, et représente donc un candidat prometteur dans le cadre du développement de nouveaux agents thérapeutiques. Ensuite, après avoir exprimé et purifié les phosphatases Cdc25A, B et C humaines sous la forme d une protéine de fusion, nous avons criblé de nombreuses molécules potentiellement inhibitrices de Cdc25, et mis en évidence l intérêt d analogues de l anhydride maléique possédant une chaîne grasse de taille variable. Les plus actifs de ces composés présentent des CI50 inférieures à 10 M et leur activité semble dépendre de la longueur de la chaîne alkyle. Les dérivés les plus actifs in vitro sont également efficaces chez MCF7 où ils produisent un blocage du cycle cellulaire avec une induction de l apoptose. Ils sont également capables de potentialiser les effets de l adriamycine et du cisplatine chez des cellules sensibles et résistantes. Ces résultats apportent des pistes intéressantes pour le développement de molécules thérapeutiques nouvellesIn mammalian cells, three dual specific phosphatases Cdc25A, B, and C contribute to the cell proliferation control by activating cyclin/Cdk complexes. Considering their functional impact, these cell cycle regulatory molecules constitute attractive therapeutic targets. We first characterized the Cdk inhibitory potential of kenpaullone analogues in two breast adenocarcinoma cell lines, a sensitive one, MCF7 and its resistant counterpart Vcr-R. A bromo-substituted analogue, weakly active in resistant cells, displayed in MCF7 antiproliferative and pro-apoptotic activities that render it interesting in future development of new drugs. Subsequently, we produced human Cdc25A, B et C as fusion proteins. Among a large number of tested molecules for their Cdc25 inhibitory potential, maleic anhydride analogues were identified with IC50 below 10 M for the most active ones. Activity seemed to depend on the alkyl chain length. The most in vitro active compounds induced cell cycle blockage and apoptosis in the MCF7 sensitive cell line. These compounds were also able to increase adriamycin and cisplatin effects in sensitive and resistant cells when applied as a pre-treatment. These research outcomes are thus particularly useful in drug designMETZ-SCD (574632105) / SudocSudocFranceF

Etude épidémiologique et moléculaire des voies métaboliques associées au glutathion dans le cancer du sein

NANCY1-SCD Medecine (545472101) / SudocPARIS-BIUM (751062103) / SudocSudocFranceF

Découverte, identification et caractérisation de molécules d'origine naturelle capables de cibler les voies de transduction, de prolifération, d'inflammation et de mort cellulaire dans des cellules cancéreuses

Le cancer est un problème majeur de santé public avec une estimation de plus de 1,3 millions de décès en Europe pour l'année 2013. La recrudescence de résistances vis-à-vis des traitements chimio-thérapeutiques conduit à la recherche de nouvelles substances actives, notamment au sein d'organismes naturels, qui représentent une source infinie de molécules de structure très hétéroclite pouvant avoir des applications thérapeutiques très variées. Dans la première partie de ce projet, nous avons étudié l'effet de la curcumine, molécule extraite à partir du rhizome du Curcuma longa, sur la voie de signalisation Wingless (Wnt) dans le cas du cancer de la prostate. Nos résultats ont démontré que cette molécule naturelle peut être considérée comme une alternative non-toxique pour prévenir la progression du cancer de la prostate et en éradiquer le stade précoce androgéno-dépendant. La seconde partie de notre projet a consisté en l'isolement de molécules anti-cancéreuses à partir de la plante carnivore Dionaea muscipula. Après avoir sélectionné et identifié une substance qui s'est révélé être de la plumbagine, nous avons étudié les raisons pouvant expliquer la différence de cytotoxicité de cette dernière sur des lignées hématopoïétiques. Nos résultats laissent penser que cette molécule affecte les groupements thiols de certaines protéines. En conclusion, ces études du potentiel chimiopréventif de la curcumine dans le cancer de la prostate et celui de la plumbagine dans les leucémies présentent ces molécules d'origine naturelle comme de bons candidats pouvant servir de base au développement des futurs médicaments anti-cancéreuxToday, cancer has become a major public health problem and we estimate more than 1.3 million cancer-related deaths in Europe in 2013. The emergence of cancer resistances towards chemotherapeutic treatments forces to the discovery of new drugs. Natural organisms are a virtually inexhaustible source of molecules structurally very heterogeneous and having varied therapeutic applications. In the first part of this project, we studied the effect of curcumin, a molecule isolated from the roots of Curcuma longa, on the Wingless (Wnt) signalling pathway in the case of prostate cancer. Our results emphasize the chemopreventive potential of curcumin in prostate cancer. This natural molecule can be considered as an alternative modality, non-toxic to prevent the progression of prostate cancer and to eradicate the androgen-dependent early stage. The second part of the project involved the isolation of anti-cancer molecules from the carnivorous plant Dionaea muscipula. After selection and identification of a substance which turned out to be plumbagin, we investigated the possible reasons for the differential plumbagin sensitivity of hematopoietic cell lines. Our results suggest that this molecule affects the thiol groups of some proteins. In conclusion, the example of curcumin as chemopreventive agent in the development of prostate cancer and plumbagin in the treatment of leukemia have shown that naturally occurring substances are excellent candidates for the development of future anti-cancer drugsNANCY-INPL-Bib. électronique (545479901) / SudocSudocFranceF

Criblage d'inhibiteurs réversibles et irréversibles des phosphatases CDC25s par spectrométrie de masse (Application à des extraits d'origine végétale)

Les protéines CDC25 (Cell Cycle Division 25) sont des régulateurs clés de la progression du cycle cellulaire et leur surexpression a été reportée dans de nombreux types de cancers. Leur inhibition apparait donc intéressante dans le cadre de traitements anticancéreux. L'objet de ces recherches a été de développer un test de criblage permettant de détecter les inhibiteurs réversibles et irréversibles des CDC25s, puis d'appliquer ce test à des extraits végétaux. La première partie implique la spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice couplée à un détecteur à temps de vol (MALDI-TOFMS) afin de détecter les molécules se liant aux CDC25s avec une liaison faible (inhibiteurs réversibles). La deuxième partie de ce test beaucoup plus innovante consiste à mettre en évidence les ligands se liant avec une liaison plus forte (inhibiteurs irréversibles) aux CDC25s. Pour cela, une étape de digestion trypsique des protéines est réalisée, puis l'étude de l'empreinte peptidique massique est procédée sur le digest afin de déceler les inhibiteurs irréversibles. En parallèle, nous nous sommes intéressés à l'application de ce test à des extraits végétaux dans le but d'identifier de nouveaux inhibiteurs des CDC25s. L'activité inhibitrice de CDC25s de ces extraits est également évaluée in vitro grâce à des tests biologiques visant à compléter les premiers résultats obtenus lors du criblage par spectrométrie de masse. De ces travaux il résulte qu'une molécule encore non connue pour son activité sur CDC25s a montré un potentiel effet inhibiteur de ces protéines et cytotoxique sur lignées cellulaires humainesThe CDC25s phosphatases are key regulators of the physiological cell cycle progression. Their overexpression has been reported in a significant number of cancers and their inhibition appears to be an interesting strategy for treatments. We propose here a rapid screening test allowing the detection of reversible and irreversible CDC25 inhibitors. The test is based on the incubation of the candidate molecules with the human CDC25 proteins followed by an ultrafiltration step. The retentate is then directly analyzed by MALDI-TOFMS to detect reversible inhibitors or submitted to PMF analysis to reveal irreversible inhibitors. In parallel we applied this test to vegetable extracts in order to identify novel CDC25 inhibitors. The CDC25s inhibitory activity of these extracts is also evaluated in vitro thanks to biological tests. It results from this work that one molecule never known for its activity on the CDC25s shows a potential inhibitory effect and is cytotoxic on human cellular lineageNANCY-INPL-Bib. électronique (545479901) / SudocSudocFranceF

Inhibition des phosphatases CDC 25 dans le cadre d'une thérapie anticancéreuse (étude mécanistique de nouveaux inhibiteurs)

Dans le cadre de la recherche de nouvelles cibles pour le traitement du cancer, les phosphatases Cdc25 sont des candidats intéressants dont l'inhibition devrait permettre de ralentir la croissance tumorale et éventuellement d'améliorer les traitements actuellement en usage. Les objectifs de ce projet de thèse sont de concevoir et synthétiser de nouveaux composés capables d'inhiber les CDC25, et de déterminer l'efficacité des meilleurs composés dans les lignées cellulaires du cancer du sein. L'évaluation du potentiel inhibiteur des composés est réalisée in vitro par une méthode fluorimétrique très sensibilité (substrat 3-OMFP). Les effets des composés sont évalués dans les lignées cellulaires MCF-7 et MDA-MB-231 : La viabilité des cellules est évaluée par la méthode colorimétrique du MTT, la cytotoxicité est évaluée par coloration au bleu trypan et par observation microscopique avec le système de vidéomicroscopie Incucyte. La mort cellulaire est caractérisée par la détection de marqueurs apoptotiques (caspases) et de marqueurs des dommages de l'ADN (H.2AX Histone PARP) par western blot. L'analyses des mécanismes liés à la mort cellulaire sont explorées par cytométrie en flux via la détection d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) avec les sondes H2DCFDA et Redox Sensor Red. L'inhibition de CDC25 dans les cellules est évaluée indirectement par détection des formes phosphorylées dse CDK en Western Blot. L'évaluation in vitro de 93 molécules synthétisées nous a permis d'identifier de nouveaux composés actifs. Ils appartiennent à diverses familles chimiques comprenant des stéroïdes, thiophènes, coumarines, imidazoles ainsi que des dérivés de quinone. Les dérivés coumariniques ont montré une intéressante inhibition de CDC25, non décrite jusqu'à présent. Une nouvelle structure coumarine-soufre-quinone, nommée SV37, a été conçue pour optimiser le potentiel d'inhibition. Ce composé présente un fort potentiel inhibiteur des CDC25 in vitro (CI50 < 5uM pour CDC25 A et C). L'effet de SV37 sur la croissance cellulaire a été évalué sur les lignées cellulaires MCF-7, MDA-MB-231, hTERT-HME1 et HepG2 sur lesquelles une inhibition de la croissance cellulaire est observée (CI50 de 9 à 18 M). L'analyse de la viabilité des cellules traitées à la CI50 indique l'absence de mort cellulaire pour la lignée MCF7, tandis que pour la lignée MDA-MB-231 la diminution de la croissance cellulaire est liée à une augmentation de la mort cellulaire. Afin d'étudier les mécanismes liés à la mort cellulaire, nous nous sommes concentrés sur l'étude du modèle triple négatif MDA-MB- 231. Les modifications morphologiques de ces cellules sont caractérisées par l'apparition d'altérations cellulaires compatibles avec la mort cellulaire. Le clivage des caspase-3 et 7 a été observé dès 16h de traitement, ce qui suggère l'induction d'une mort apoptotique. Par ailleurs, des ERO ont été détectées 15 min après le début du traitement, cette émission d'ERO a pu être totalement bloquée par un prétraitement avec la N-acétylcystéine (NAC). La détection de marqueurs des dommages de l'ADN, entre 16 et 28 heures après début du traitement, corrobore l'activation des caspases et les observations réalisées en vidéo-microscopie. Après traitement à CI50, une accumulation des pCDK dans les cellules a été observée après 4 et 8 heures, suggérant une inhibition de l'activité CDC25. De plus, les cellules prétraitées avec la NAC n'ont montré aucune accumulation de pCDK après traitement par SV37. Ces résultats suggèrent un lien direct entre la production de ROS induit par le composé SV37 et l'inhibition des CDC25. Ce projet a permis de définir les coumarines en tant que nouvelle classe de composés inhibitrice des phosphatases CDC25. Ces travaux ont de plus permis l'identification d'un composé coumarine-soufre-quinone SV37 qui constitue une structure de base pour le développement d'inhibiteurs de plus en plus efficaces, ...Within the context of research for new targets for cancer therapy, Cdc25 phosphatases are interesting candidates, the inhibition of which being able to slow down tumor growth and eventually improve the cancer treatments currently in use. The objectives of this PhD project are to design and synthesize new compounds able to inhibit CDC25 and to determine efficiency of identified compounds in breast cancer cell lines. In vitro evaluation of inhibitory potential of compound is realized through a high sensitivity fluorometric method (3-OMFP substrate). Cellular effects were evaluated in MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines. Effects on cell viability are assessed through MTT assays, and cytotoxicity is evaluated through trypan blue assays and microscopic observations with Incucyte videomicroscopy system. Cell death was characterized by detection of apoptotic markers (caspases) and DNA damages markers (PARP Histone H.2AX) by Western Blotting. The analyses of mechanisms underlying cell death were explored through cytometric detection of reactive oxygen species (ROS) with H2DCFDA and Redox Sensor Red probes. Inhibition of CDC25 in cells was indirectly evaluated through detection of phosphorylated forms of CDK by Western Blotting. In vitro evaluation of 93 synthesized compounds allowed us to find new active compound in various chemical families including steroid, thiophene, coumarinic, imidazole and quinone derivatives. The coumarinic derivatives showed potent CDC25 inhibition. A new coumarin-sulfurquinone combined structure, named SV37, was designed to optimize efficiency of inhibition. In vitro tests on this compound, showed a strong CDC25 inhibitory potential (IC50 under 5 M for CDC25 A and C). Effect of SV37 on cell growth was evaluated on various cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, hTERT-HME1 and HepG2). Results indicate inhibition of cell growth (IC50 values from 9 to 18 M). Analysis of cell viability indicates no remarkable cell death in MCF7 at IC50 value whereas in MDA-MB-231 the cell growth decrease was characterized by an increase of cell death. For deeper investigations on the cell death and on the underlying mechanisms, we focused the study on the triple negative model MDA-MB-231. The morphological changes of MDA-MB-231 cells during the treatment were characterized by the appearance of cellular alterations compatible with a cellular demise and culminating with a disruption of cells after 20h. Caspase-3 and 7 cleavages were observed 16h after beginning of the treatment, suggesting an apoptotic cell death. A ROS induction was observed 15 min after the beginning of the treatment and was totally prevented by Nacetylcysteine (NAC) pretreatment. DNA damage markers were detected between 16 and 28 hours after beginning of treatment, a timing falling with caspase activation and with the appearance of cell demise observed by video microscopy. Accumulation of pCDK in cells was observed after 4 and 8 hr of treatment by SV37 at IC50 suggesting an inhibition of CDC25 activity, and cells pretreated with NAC showed no accumulation of pCDK after SV37 treatment. This strongly suggests a direct link between ROS generation by the compound SV37 and the accumulation of pCDK. This project increased knowledge on inhibitors of CDC25 phosphatases and allowed the identification of coumarine compound as new CDC25 inhibitors. This work will enable the development of ever more efficient inhibitors, leading to efficient inhibition of CDC25 and inhibition of tumor developmentMETZ-SCD (574632105) / SudocNANCY1-Bib. numérique (543959902) / SudocNANCY2-Bibliotheque electronique (543959901) / SudocNANCY-INPL-Bib. électronique (545479901) / SudocSudocFranceF