Caspase-7 uses an exosite to promote poly(ADP ribose) polymerase 1 proteolysis

During apoptosis, hundreds of proteins are cleaved by caspases, most of them by the executioner caspase-3. However, caspase-7, which shares the same substrate primary sequence preference as caspase-3, is better at cleaving poly(ADP ribose) polymerase 1 (PARP) and Hsp90 cochaperone p23, despite a lower intrinsic activity. Here, we identified key lysine residues (K38KKK) within the N-terminal domain of caspase-7 as critical elements for the efficient proteolysis of these two substrates. Caspase-7’s N-terminal domain binds PARP and improves its cleavage by a chimeric caspase-3 by !30-fold. Cellular expression of caspase-7 lacking the critical lysine residues resulted in less-efficient PARP and p23 cleavage compared with cells expressing the wild-type peptidase. We further showed, using a series of caspase chimeras, the positioning of p23 on the enzyme providing us with a mechanistic insight into the binding of the exosite. In summary, we have uncovered a role for the N-terminal domain (NTD) and the N-terminal peptide of caspase-7 in promoting key substrate proteolysis

Identification of Early Intermediates of Caspase Activation Using Selective Inhibitors and Activity-Based Probes

Caspases are cysteine proteases that are key effectors in apoptotic cell death. Currently, there is a lack of tools that can be used to monitor the regulation of specific caspases in the context of distinct apoptotic programs. We describe the development of highly selective inhibitors and active site probes and their applications to directly monitor executioner (caspase-3 and -7) and initiator (caspase-8 and -9) caspase activity. Specifically, these reagents were used to dissect the kinetics of caspase activation upon stimulation of apoptosis in cell-free extracts and intact cells. These studies identified a full-length caspase-7 intermediate that becomes catalytically activated early in the pathway and whose further processing is mediated by mature executioner caspases rather than initiator caspases. This form also shows distinct inhibitor sensitivity compared to processed caspase-7. Our data suggest that caspase-7 activation proceeds through a previously uncharacterized intermediate that is formed without cleavage of the intact zymogen

Étude de la région riche en résidus cystéine de la convertase de mammifère humaine SPC1/furine

SPC1/furine est une protéase à sérine dépendante du Ca[exposant]++ membre de la famille des convertases de mammifère et responsable de la maturation de plusieurs précurseurs protéiques tels pro-ADAMTSI, gp160 du HIV-1 et la pro-fibrilline. Un de ses domaines, la région riche en résidus cystéine (RRC), n'a pas de fonction connue. Trois approches furent utilisées afin d'élucider le rôle de la RRC. (1) L'expression de SPC1 dans un modèle de cellules d'insectes et la caractérisation enzymatique de deux formes tronquées, avec et sans RRC, a permis d'établir que la RRC n'a aucune influence sur les paramètres cinétiques de l'enzyme. Cependant, la RRC permet de stabiliser l'enzyme lui permettant d'être active 3 fois plus longtemps. (2) L'importance de la RRC dans la biosynthèse de SPC1 fut étudiée à l'aide de mutants de délétion et de protéines chimériques SPC1 et SPC4. L'expression dans les cellules 293 et l'analyse par marquage métabolique et immunoprécipitation permet [i.e. permettent] d'établir que, contrairement à SPC4, la RRC n'influence pas la biosynthèse de SPC1. La délétion de la RRC de SPC4 diminue l'efficacité d'autoactivation de l'enzyme; l'échange de la RRC de SPC4 par celle de SPC1 ne permet pas de rétablir l'activation efficace de SPC4 suggérant que chaque RRC est spécifique à son enzyme. Enfin, lorsque la RRC de SPC4 est greffée à SPC1 la protéine chimérique se retrouve dans des corps d'inclusion. (3) La RRC de SPC1 est homologue à celle de TNFRI/II. Des mutations dans cette région de TNFRI sont à l'origine du syndrome familial de fièvre épisodique. Des mutations similaires de SPC1 (C614Y/C641F) causent, tout comme pour TNFRI, une diminution marquée du largage. L'étude cinétique montre que le largage est le mécanisme utilisé par les cellules 293 pour réguler le niveau de SPC1 membranaire. Des études avec des inhibiteurs de protéases, agent acidotropiques et la biotinylation des protéines de surface montrent que le largage est fait par une protéase à sérine dépendante du Ca[exposant]++ et a lieu dans la voie endosomale. Finalement, le site de largage a été délimité aux résidus 683-687 de SPC1

Caractérisation des convertases furine/Pace et Pace4 pouvant être impliquées dans la maturation du précurseur proendothéline-1 humain

Les convertases furine/PACE/SPC1 et PACE4 font partie d'une famille de protéases maturant les précurseurs protéiques en polypeptides matures. La furine et PACE4 sont des sérine-protéases résidant dans la voie de sécrétion constitutive des protéines. Elles sont connues pour maturer les précurseurs à des sites Arg-X-Lys/Arg-Arg. La furine est reconnue pour maturer plusieurs précurseurs dont le pro-?-NGF, gp160 de HIV-1, l'antigène protecteur de B. anthracis, le pro-facteur von Willebrand et le pro-TGF?. Les substrats de PACE4 sont inconnus. L'endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoconstricteur très puissant produit par l'endothélium. Composé de 21 a.a., l'ET-1 est issue d'un précurseur de 212 a.a., la préproET-1. Afin de libérer la portion BigET-1, peptide immédiat dans la voie de biosynthèse de l'ET-1, le précurseur doit subir une double protéolyse aux sites Arg-Ser-Lys-Arg52? et Arg-Ser-Lys-Arg92?. Nous proposons que la furine ou PACE4 puissent être impliqués dans la maturation du précurseur de l'ET-1. Les travaux présentés montrent que les cellules endothéliales (CEs) d'aorte bovine expriment l'ARNm de 4.4 kb de la furine et non celui de PACE4. L'infection de cellules BSC 40 avec le recombinant du virus vaccinia vv:hFUR, exprimant la furine, produit une forme sécrétée (80 kDa) de la furine. Cette forme est active et possède un KM et VMAX de 3.4 nmoles/min et 27 µM respectivement avec le substrat boc-Arg-Val-Arg-Arg-4-méthyl-7-amidocoumarine. Ceci est comparable à la forme hFUR713t qui est construite pour être sécrétée et partage toute les caractéristiques enzymatique de la furine native. L'étude montre que la proET-1 recombinante est complètement maturée par la furine qui produit l'intermédiaire BigET-1-Lys-Arg. Cet intermédiaire peut être ensuite converti par la chymosine en ET-1 qui a une activité vasoconstrictrice sur le vas déférent de rat ou la carotide de lapin via le récepteur ETA. PACE4 mature difficilement et de manière différente la proET-1. Lorsque la furine est incubée avec le substrat boc-RVRR-MAC ou la proET-l, l'?1-antitrypsine Portland à 1.0 µg/ml (K1 = 3.6 nM) inhibe entièrement l'activité de la furine. PACE4 n'est pas affectée par cette serpine. Finalement, la production d'ET-1 par les CEs est diminuée de 50 % par le décanoyl-RVKR-chlorométhylcétone à 10 µM, un inhibiteur suicide dirigé contre le site actif des convertases. Ces résultats suggèrent que la furine, et non PACE4, peut être impliquée dans la maturation initiale de la proET-1 en BigET-1

Étude de la région riche en résidus cystéine de la convertase de mammifère humaine SPC1/furine

SPC1/furine est une protéase à sérine dépendante du Ca[exposant]++ membre de la famille des convertases de mammifère et responsable de la maturation de plusieurs précurseurs protéiques tels pro-ADAMTSI, gp160 du HIV-1 et la pro-fibrilline. Un de ses domaines, la région riche en résidus cystéine (RRC), n'a pas de fonction connue. Trois approches furent utilisées afin d'élucider le rôle de la RRC. (1) L'expression de SPC1 dans un modèle de cellules d'insectes et la caractérisation enzymatique de deux formes tronquées, avec et sans RRC, a permis d'établir que la RRC n'a aucune influence sur les paramètres cinétiques de l'enzyme. Cependant, la RRC permet de stabiliser l'enzyme lui permettant d'être active 3 fois plus longtemps. (2) L'importance de la RRC dans la biosynthèse de SPC1 fut étudiée à l'aide de mutants de délétion et de protéines chimériques SPC1 et SPC4. L'expression dans les cellules 293 et l'analyse par marquage métabolique et immunoprécipitation permet [i.e. permettent] d'établir que, contrairement à SPC4, la RRC n'influence pas la biosynthèse de SPC1. La délétion de la RRC de SPC4 diminue l'efficacité d'autoactivation de l'enzyme; l'échange de la RRC de SPC4 par celle de SPC1 ne permet pas de rétablir l'activation efficace de SPC4 suggérant que chaque RRC est spécifique à son enzyme. Enfin, lorsque la RRC de SPC4 est greffée à SPC1 la protéine chimérique se retrouve dans des corps d'inclusion. (3) La RRC de SPC1 est homologue à celle de TNFRI/II. Des mutations dans cette région de TNFRI sont à l'origine du syndrome familial de fièvre épisodique. Des mutations similaires de SPC1 (C614Y/C641F) causent, tout comme pour TNFRI, une diminution marquée du largage. L'étude cinétique montre que le largage est le mécanisme utilisé par les cellules 293 pour réguler le niveau de SPC1 membranaire. Des études avec des inhibiteurs de protéases, agent acidotropiques et la biotinylation des protéines de surface montrent que le largage est fait par une protéase à sérine dépendante du Ca[exposant]++ et a lieu dans la voie endosomale. Finalement, le site de largage a été délimité aux résidus 683-687 de SPC1

Caractérisation des convertases furine/Pace et Pace4 pouvant être impliquées dans la maturation du précurseur proendothéline-1 humain

Les convertases furine/PACE/SPC1 et PACE4 font partie d'une famille de protéases maturant les précurseurs protéiques en polypeptides matures. La furine et PACE4 sont des sérine-protéases résidant dans la voie de sécrétion constitutive des protéines. Elles sont connues pour maturer les précurseurs à des sites Arg-X-Lys/Arg-Arg. La furine est reconnue pour maturer plusieurs précurseurs dont le pro-?-NGF, gp160 de HIV-1, l'antigène protecteur de B. anthracis, le pro-facteur von Willebrand et le pro-TGF?. Les substrats de PACE4 sont inconnus. L'endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoconstricteur très puissant produit par l'endothélium. Composé de 21 a.a., l'ET-1 est issue d'un précurseur de 212 a.a., la préproET-1. Afin de libérer la portion BigET-1, peptide immédiat dans la voie de biosynthèse de l'ET-1, le précurseur doit subir une double protéolyse aux sites Arg-Ser-Lys-Arg52? et Arg-Ser-Lys-Arg92?. Nous proposons que la furine ou PACE4 puissent être impliqués dans la maturation du précurseur de l'ET-1. Les travaux présentés montrent que les cellules endothéliales (CEs) d'aorte bovine expriment l'ARNm de 4.4 kb de la furine et non celui de PACE4. L'infection de cellules BSC 40 avec le recombinant du virus vaccinia vv:hFUR, exprimant la furine, produit une forme sécrétée (80 kDa) de la furine. Cette forme est active et possède un KM et VMAX de 3.4 nmoles/min et 27 µM respectivement avec le substrat boc-Arg-Val-Arg-Arg-4-méthyl-7-amidocoumarine. Ceci est comparable à la forme hFUR713t qui est construite pour être sécrétée et partage toute les caractéristiques enzymatique de la furine native. L'étude montre que la proET-1 recombinante est complètement maturée par la furine qui produit l'intermédiaire BigET-1-Lys-Arg. Cet intermédiaire peut être ensuite converti par la chymosine en ET-1 qui a une activité vasoconstrictrice sur le vas déférent de rat ou la carotide de lapin via le récepteur ETA. PACE4 mature difficilement et de manière différente la proET-1. Lorsque la furine est incubée avec le substrat boc-RVRR-MAC ou la proET-l, l'?1-antitrypsine Portland à 1.0 µg/ml (K1 = 3.6 nM) inhibe entièrement l'activité de la furine. PACE4 n'est pas affectée par cette serpine. Finalement, la production d'ET-1 par les CEs est diminuée de 50 % par le décanoyl-RVKR-chlorométhylcétone à 10 µM, un inhibiteur suicide dirigé contre le site actif des convertases. Ces résultats suggèrent que la furine, et non PACE4, peut être impliquée dans la maturation initiale de la proET-1 en BigET-1

Caspase-7 uses an exosite to promote poly(ADP ribose) polymerase 1 proteolysis

During apoptosis, hundreds of proteins are cleaved by caspases, most of them by the executioner caspase-3. However, caspase-7, which shares the same substrate primary sequence preference as caspase-3, is better at cleaving poly(ADP ribose) polymerase 1 (PARP) and Hsp90 cochaperone p23, despite a lower intrinsic activity. Here, we identified key lysine residues (K38KKK) within the N-terminal domain of caspase-7 as critical elements for the efficient proteolysis of these two substrates. Caspase-7’s N-terminal domain binds PARP and improves its cleavage by a chimeric caspase-3 by !30-fold. Cellular expression of caspase-7 lacking the critical lysine residues resulted in less-efficient PARP and p23 cleavage compared with cells expressing the wild-type peptidase. We further showed, using a series of caspase chimeras, the positioning of p23 on the enzyme providing us with a mechanistic insight into the binding of the exosite. In summary, we have uncovered a role for the N-terminal domain (NTD) and the N-terminal peptide of caspase-7 in promoting key substrate proteolysis