IL GENE INTERFERON-INDUCIBILE IFI16: POTENZIALE FATTORE ANTIVIRALE E MARCATORE DIAGNOSTICO DELLE INFEZIONI DA PAPILLOMAVIRUS UMANI

I recenti progressi nel campo dell\u2019immunit\ue0 innata hanno portato alla scoperta di numerose classi di pattern recognition receptors (PRRs), sensori in grado di rilevare i cosiddetti pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). Tra i PRRs intracellulari, alcune proteine della famiglia dei geni IFN-inducibili HIN200 sono state caratterizzate quali sensori del DNA degli Herpesvirus. Dal momento che i Papillomavirus sono virus a DNA con replicazione nucleare come gli Herpesvirus si \ue8 voluto verificare se la famiglia HIN200, in particolare la proteina IFI16, fosse coinvolta nel riconoscimento e nella modulazione della replicazione di questi virus. Sono state condotte indagini sia in vitro, su un modello di replicazione per HPV18, sia in vivo su sezioni di cervice uterina HPV positive. L\u2019analisi in immunofluorescenza di sezioni di cervice uterina con vari gradi di displasia HPV-associata ha evidenziato una ridotta espressione di IFI16 soprattutto nelle cellule con attiva replicazione del genoma virale dimostrata mediante ibridazione in situ. Per confermare i dati ottenuti in vivo, cheratinociti umani primari spontaneamente immortalizzati (NIKS), sono stati elettroporati con il genoma completo circolare di HPV18. Per riprodurre il normale differenziamento epiteliale necessario per supportare la replicazione virale di HPV, sono stati utilizzati due diversi approcci: i)cellule coltivate in monostrato, indotte alla differenziazione con metilcellulosa per 72h; oppure ii)cellule utilizzate per allestire colture organotipiche, un sistema di coltivazione in 3D che permette la formazione di un epitelio completo in vitro (skin-like structures). I risultati ottenuti hanno permesso di confermare che la replicazione di HPV18 si accompagna ad una riduzione dell\u2019espressione di IFI16. Inoltre, cellule silenziate per IFI16 tramite siRNA specifici presentano una maggiore resa virale, come dimostrato da analisi in Real-Time PCR quantitativa; mentre, in cellule overesprimenti IFI16, tramite un vettore adenovirale (AdvIFI16), la replicazione risulta ridotta rispetto a cellule infettate con un vettore adenovirale di controllo (AdvLACZ). Nell\u2019insieme i risultati ottenuti indicano che IFI16 agisce come sensore del DNA e come fattore di restrizione anche nei confronti di altri virus a DNA quali i Papillomavirus

NUOVO MECCANISMO DI EVASIONE DEL CITOMEGALOVIRUS UMANO DAL FATTORE DI RESTRIZIONE IFI16

Il sistema immunitario dispone di meccanismi di difesa cellulari definiti \u201cintrinseci\u201d che conferiscono alle cellule la capacit\ue0 di resistere ai microrganismi patogeni. Componenti essenziali del SI innato sono i cosiddetti \u201cfattori di restrizione\u201d espressi costitutivamente e attivi prima che un patogeno penetri all\u2019interno delle cellule. Il Citomegalovirus umano (HCMV) ha evoluto meccanismi per evadere lo stato antivirale indotto da tali fattori. Tra i fattori di restrizione intracellulari proteine codificate dalla famiglia di geni Interferon-inducibili HIN200 sono in grado di inibire la replicazione degli Herpesvirus. In particolare il nostro gruppo di ricerca ha recentemente dimostrato che IFI16 agisce come fattore di restrizione verso HCMV inibendo l\u2019espressione dei geni virali precoci e tardivi (Gariano, Dell\u2019Oste et al Plos Path 2012). Nel presente lavoro sono stati studiati i meccanismi che permettono agli Herpesvirus di eludere i sistemi di riconoscimento innato per stabilire infezioni persistenti, con particolare riferimento al processo di evasione che permette ad HCMV di interferire con l\u2019attivit\ue0 antivirale di IFI16. Analisi in microscopia confocale hanno evidenziato in fibroblasti primari (HELF) infettati da HCMV (AD169) la delocalizzazione di IFI16 dal nucleo a partire da 24 ore post-infezione. Per chiarire i meccanismi molecolari alla base di questo fenomeno \ue8 stata analizzata la chinasi virale pUL97, componente essenziale del complesso di egressione dal nucleo di HCMV. Abbiamo dimostrato che pUL97 lega e fosforila IFI16 determinando la sua uscita dal nucleo delle cellule infette. Analisi in microscopia elettronica hanno inoltre rilevato IFI16 all\u2019interno di virioni maturi, indicando che per sovvertire l\u2019attivit\ue0 antivirale di IFI16 HCMV delocalizza la proteina e la incorpora nelle particelle virali mature. Nell\u2019insieme questi risultati evidenziano un nuovo meccanismo di evasione operato da HCMV nei confronti dell\u2019attivit\ue0 di restrizione dei geni indotti da Interferon tra i quali la proteina IFI16 svolge un ruolo centrale