Spécificité d’import et de transformation des agrocinopines et dérivés chez les pathogènes du genre Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens is a soil bacterial species that infects over 600 plant species. It is responsible for the development of crown gall. During infection, the bacterium transfers to the plant cell a T-DNA located on the virulence plasmid Ti (Tumor inducing). The T-DNA integrates with the plant’s genomic DNA and diverts certain metabolic pathways, such as the production of plant nutrients and hormones, to the benefit of the bacterium. Plant hormones induce the development of tumours that serve as ecological niches for bacteria. The nutrients, called opines, which are phosphorylated sugars in the case of agrocinopines, are only usable by the bacterium. These agrocinopines serve as a carbon source and initiate the synthesis of quorum sensing signals. The opines produced by the plant differ according to the strains of A. tumefaciens and are determined by the bacterial gene acs (agrocinopine synthase). For example, the model strain C58 transfers the acs gene with the particularity of making the plant produce the A and B agrocinopines, while for the strain Bo542 it is the production of the C and D agrocinopines. Once produced, agrocinopines are initially recognized by a periplasmic binding protein (PBP) AccA , which allows their internalization in the cytoplasm of the bacterium, then are transformed by phosphodiesterase AccF .During this thesis, through biochemical and structural approaches, I was interested in the specificity of recognition of the PBP AccA strains A. tumefaciens Bo542 and S4 vis-à-vis the 4 agrocinopines and their intermediaries. I was able to establish by techniques of protein/ligand interaction that AccABo542 specifically recognized the C and D agrocinopines, contrary to the C58 and S4 strains that recognize the 4 agrocinopines. In order to understand the molecular basis of the specificity of AccABo542, I then carried out a structural crystallography study to identify residues potentially involved in the specificity of this protein. I was also interested in phosphodiesterase AccF from a structural and functional point of view in order to understand its reaction mechanism. The results obtained, combined with the previously published scientific data, identified the residues involved in the reaction mechanism and the residues potentially involved in the recognition of the substrate.All these studies provided a better understanding of the recognition and transformation of agrocinopines by bacteria of the genus Agrobacterium (strains A. tumefaciens C58/Bo542 and A. vitis S4).Agrobacterium tumefaciens est une espèce bactérienne du sol qui infecte plus de 600 espèces de plantes. Elle est responsable du développement de la galle du collet. Lors de l’infection, la bactérie transfère au sein de la cellule végétale un ADN-T situé sur le plasmide de virulence Ti (Tumor inducing). L’ADN-T s’intègre à l’ADN génomique de la plante et détourne, au profit de la bactérie, certaines voies métaboliques comme la production de nutriments et d’hormones végétales. Les hormones végétales induisent le développement des tumeurs servant de niches écologiques aux bactéries. Les nutriments, appelés opines, qui sont des sucres phosphorylés dans le cas des agrocinopines, sont uniquement utilisables par la bactérie. Ces agrocinopines lui servent de source de carbone et initient la synthèse de signaux de quorum sensing. Les opines produites par la plante diffèrent en fonction des souches d’A. tumefaciens et sont déterminées par le gène bactérien acs (agrocinopine synthase). Par exemple, la souche modèle C58 transfère un gène acs ayant la particularité de faire produire à la plante les agrocinopines A et B, alors que pour la souche Bo542 il s’agit de la production des agrocinopines C et D. Une fois produites, les agrocinopines sont reconnues dans un premier temps par une protéine périplasmique (PBP) AccA, qui permet leur internalisation dans le cytoplasme de la bactérie, puis sont transformées par la phosphodiesterase AccF. Durant cette thèse, par des approches biochimiques et structurales, je me suis intéressé à la spécificité de reconnaissance de la PBP AccA des souches A. tumefaciens Bo542 et S4 vis-à-vis des 4 agrocinopines et de leurs intermédiaires. J’ai pu établir par des techniques d’interaction protéine/ligand qu’AccABo542 reconnaissait spécifiquement les agrocinopines C et D, contrairement au souches C58 et S4 qui reconnaissant les 4 agrocinopines. Dans le but de comprendre les bases moléculaires de la spécificité d’AccABo542, j’ai ensuite réalisé une étude structurale par cristallographie afin d’identifier des résidus potentiellement impliqués dans la spécificité de cette protéine. Je me suis également intéressé à la phosphodiesterase AccF d’un point de vue structural et fonctionnel afin de comprendre son mécanisme réactionnel. Les résultats obtenus combinées aux données scientifiques déjà publiées ont permis d’identifier les résidus impliqués dans le mécanisme réactionnel et les résidus potentiellement impliqués dans la reconnaissance du substrat.L’ensemble de ces études ont permis d’avoir une meilleure compréhension de la reconnaissance et de la transformation des agrocinopines par les bactéries du genre Agrobacterium (souches A. tumefaciens C58/Bo542 et A. vitis S4)

Spécificité d’import et de transformation des agrocinopines et dérivés chez les pathogènes du genre Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens is a soil bacterial species that infects over 600 plant species. It is responsible for the development of crown gall. During infection, the bacterium transfers to the plant cell a T-DNA located on the virulence plasmid Ti (Tumor inducing). The T-DNA integrates with the plant’s genomic DNA and diverts certain metabolic pathways, such as the production of plant nutrients and hormones, to the benefit of the bacterium. Plant hormones induce the development of tumours that serve as ecological niches for bacteria. The nutrients, called opines, which are phosphorylated sugars in the case of agrocinopines, are only usable by the bacterium. These agrocinopines serve as a carbon source and initiate the synthesis of quorum sensing signals. The opines produced by the plant differ according to the strains of A. tumefaciens and are determined by the bacterial gene acs (agrocinopine synthase). For example, the model strain C58 transfers the acs gene with the particularity of making the plant produce the A and B agrocinopines, while for the strain Bo542 it is the production of the C and D agrocinopines. Once produced, agrocinopines are initially recognized by a periplasmic binding protein (PBP) AccA , which allows their internalization in the cytoplasm of the bacterium, then are transformed by phosphodiesterase AccF .During this thesis, through biochemical and structural approaches, I was interested in the specificity of recognition of the PBP AccA strains A. tumefaciens Bo542 and S4 vis-à-vis the 4 agrocinopines and their intermediaries. I was able to establish by techniques of protein/ligand interaction that AccABo542 specifically recognized the C and D agrocinopines, contrary to the C58 and S4 strains that recognize the 4 agrocinopines. In order to understand the molecular basis of the specificity of AccABo542, I then carried out a structural crystallography study to identify residues potentially involved in the specificity of this protein. I was also interested in phosphodiesterase AccF from a structural and functional point of view in order to understand its reaction mechanism. The results obtained, combined with the previously published scientific data, identified the residues involved in the reaction mechanism and the residues potentially involved in the recognition of the substrate.All these studies provided a better understanding of the recognition and transformation of agrocinopines by bacteria of the genus Agrobacterium (strains A. tumefaciens C58/Bo542 and A. vitis S4).Agrobacterium tumefaciens est une espèce bactérienne du sol qui infecte plus de 600 espèces de plantes. Elle est responsable du développement de la galle du collet. Lors de l’infection, la bactérie transfère au sein de la cellule végétale un ADN-T situé sur le plasmide de virulence Ti (Tumor inducing). L’ADN-T s’intègre à l’ADN génomique de la plante et détourne, au profit de la bactérie, certaines voies métaboliques comme la production de nutriments et d’hormones végétales. Les hormones végétales induisent le développement des tumeurs servant de niches écologiques aux bactéries. Les nutriments, appelés opines, qui sont des sucres phosphorylés dans le cas des agrocinopines, sont uniquement utilisables par la bactérie. Ces agrocinopines lui servent de source de carbone et initient la synthèse de signaux de quorum sensing. Les opines produites par la plante diffèrent en fonction des souches d’A. tumefaciens et sont déterminées par le gène bactérien acs (agrocinopine synthase). Par exemple, la souche modèle C58 transfère un gène acs ayant la particularité de faire produire à la plante les agrocinopines A et B, alors que pour la souche Bo542 il s’agit de la production des agrocinopines C et D. Une fois produites, les agrocinopines sont reconnues dans un premier temps par une protéine périplasmique (PBP) AccA, qui permet leur internalisation dans le cytoplasme de la bactérie, puis sont transformées par la phosphodiesterase AccF. Durant cette thèse, par des approches biochimiques et structurales, je me suis intéressé à la spécificité de reconnaissance de la PBP AccA des souches A. tumefaciens Bo542 et S4 vis-à-vis des 4 agrocinopines et de leurs intermédiaires. J’ai pu établir par des techniques d’interaction protéine/ligand qu’AccABo542 reconnaissait spécifiquement les agrocinopines C et D, contrairement au souches C58 et S4 qui reconnaissant les 4 agrocinopines. Dans le but de comprendre les bases moléculaires de la spécificité d’AccABo542, j’ai ensuite réalisé une étude structurale par cristallographie afin d’identifier des résidus potentiellement impliqués dans la spécificité de cette protéine. Je me suis également intéressé à la phosphodiesterase AccF d’un point de vue structural et fonctionnel afin de comprendre son mécanisme réactionnel. Les résultats obtenus combinées aux données scientifiques déjà publiées ont permis d’identifier les résidus impliqués dans le mécanisme réactionnel et les résidus potentiellement impliqués dans la reconnaissance du substrat.L’ensemble de ces études ont permis d’avoir une meilleure compréhension de la reconnaissance et de la transformation des agrocinopines par les bactéries du genre Agrobacterium (souches A. tumefaciens C58/Bo542 et A. vitis S4)

A highly conserved ligand-binding site for AccA transporters of antibiotic and quorum-sensing regulator in Agrobacterium leads to a different specificity

International audiencePlants genetically modified by the pathogenic Agrobacterium strain C58 synthesize agrocinopines A and B, whereas those modified by the pathogenic strain Bo542 produce agrocinopines C and D. The four agrocinopines (A, B, C and D) serve as nutrients by agrobacteria and signaling molecule for the dissemination of virulence genes. They share the uncommon pyranose-2-phosphate motif, represented by the L-arabinopyranose moiety in agrocinopines A/B and the D-glucopyranose moiety in agrocinopines C/D, also found in the antibiotic agrocin 84. They are imported into agrobacterial cytoplasm via the Acc transport system, including the solute-binding protein AccA coupled to an ABC transporter. We have previously shown that unexpectedly, AccA from strain C58 (AccAC58) recognizes the pyranose-2-phosphate motif present in all four agrocinopines and agrocin 84, meaning that strain C58 is able to import agrocinopines C/D, originating from the competitor strain Bo542. Here, using agrocinopine derivatives and combining crystallography, affinity and stability measurements, modeling, molecular dynamics, in vitro and vivo assays, we show that AccABo542 and AccAC58 behave differently despite 75% sequence identity and a nearly identical ligand binding site. Indeed, strain Bo542 imports only compounds containing the D-glucopyranose-2-phosphate moiety, and with a lower affinity compared to strain C58. This difference in import efficiency makes C58 more competitive than Bo542 in culture media. We can now explain why Agrobacterium/Allorhizobium vitis strain S4 is insensitive to agrocin 84, although its genome contains a conserved Acc transport system. Overall, our work highlights AccA proteins as a case study, for which stability and dynamics drive specificity