Modulating MIOX2 expression in Nicotiana tabacum and impacts on genes involved in cell wall biosynthesis

Cell walls are essential structures for plant development and growth. Apart from its biological functions, the polysaccharides that make cell walls (cellulose, hemicellulose and pectins) are the principal natural fibrous materials, considered the most important renewable resource on earth, used as raw material for many industrial processes among them, for pulp and paper production, charcoal, and biofuels. For all these reasons, the study of molecular composition and biosynthesis of plant cell walls has been a matter of great interest for researchers over the past few years. In this context, a full-length cDNA fragment of Miox2 gene was cloned from Arabidopsis seedlings, using RT-PCR, with an open reading frame of 954 pb and a corresponding protein subunit molecular mass of 37 kDa. The deduced amino acid sequence of the cDNA showed a high degree of homology with myo-Inosytol oxygenases from other organisms. This cDNA was used for genetic transformation of model plants (tobacco), which expressed either antisense or sense RNA. Transgenic homozygous tobacco model plants with either repression or constitutively expressed Miox2 were obtained with the number of copies varying from 1 to 7. Neither, the repression of the endogenous tobacco Miox genes or the constitutive expression of Miox2 gene, caused major impact on plant development, leaf morphology or flowering time. There was however, statistically significant (P<0.05) changes in the arabinan and D-galacturonate contents. These results clearly indicate that the modulation of the myo-Inositol pathway caused no major impact on cell wall polysaccharide biosynthesis.As paredes celulares vegetais são estruturas essenciais para o crescimento e desenvolvimento das plantas. Além de suas diversas funções biológicas, os componentes polissacarídicos constituintes das paredes celulares (celulose, hemiceluloses e pectinas) são de vital importância como fonte natural de fibras, sendo consideradas as fontes principais de recursos renováveis do planeta, utilizados como matéria prima para diversos processos industriais, dentre eles, a produção de papel e celulose, carvão vegetal e biocombustíveis. Todos esses fatores têm despertado grande interesse no estudo da composição e biossíntese das paredes celulares. Neste contexto, um fragmento de cDNA do gene Miox2 foi clonado de plântulas de Arabidopsis, via RT-PCR, com uma região aberta de leitura de 954 pb e sua proteína com massa molecular de 37kDa. A sequência deduzida de aminoácidos do cDNA apresentou alto grau de identidade com mio-Inositol oxigenases de outros organismos. Este cDNA foi usado para transformação genética de plantas modelo (tabaco) que produziram RNA antisense ou sense. Plantas de tabaco homozigotas para o transgene com repressão ou expressão constitutiva do gene Miox2 foram obtidas com um número de cópias do transgene, variando de 1 a 7. A repressão do gene Miox de tabaco endógeno assim como a expressão constitutiva do gene Miox2 de Arabidopsis não causaram alterações no desenvolvimento, morfologia foliar ou tempo de florescimento das plantas. Entretanto, alterações estatisticamente significativas (P<0.05) ocorreram no conteúdo de arabinana e de D-galacturonato. Estes resultados indicam que a modulação do metabolismo do mio-Inositol não causou grandes impactos na biossíntese dos polissacarídeos da parede celular.Fil: Defávari Nascimento, D.. Universidade do Sao Paulo. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz; BrasilFil: Conti, Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Labate, Mônica T. V.. Universidade do Sao Paulo. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz; BrasilFil: Gutmanis, Gunta. Universidade do Sao Paulo. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz; BrasilFil: Bertolo, Ana L. F.. Universidade do Sao Paulo. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz; BrasilFil: de Andrade, Alexander. Universidade do Sao Paulo. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz; BrasilFil: Bragatto, Juliano. Universidade do Sao Paulo. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz; BrasilFil: Pagotto, Luís Otávio. Universidade do Sao Paulo. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz; BrasilFil: Damin, Plínio. Universidade do Sao Paulo. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz; BrasilFil: Moon, David H.. Universidade do Sao Paulo. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz; BrasilFil: Labate, Carlos A.. Universidade do Sao Paulo. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz; Brasi

Cloning and endogenous expression of a Eucalyptus grandis UDP-glucose dehydrogenase cDNA

UDP-glucose dehydrogenase (UGDH) catalyzes the oxidation of UDP-glucose (UDP-Glc) to UDP-glucuronate (UDP-GlcA), a key sugar nucleotide involved in the biosynthesis of plant cell wall polysaccharides. A full-length cDNA fragment coding for UGDH was cloned from the cambial region of 6-month-old E. grandis saplings by RT-PCR. The 1443-bp-ORF encodes a protein of 480 amino acids with a predicted molecular weight of 53 kDa. The recombinant protein expressed in Escherichia coli catalyzed the conversion of UDP-Glc to UDP-GlcA, confirming that the cloned cDNA encodes UGDH. The deduced amino acid sequence of the cDNA showed a high degree of identity with UGDH from several plant species. The Southern blot assay indicated that more than one copy of UGDH is present in Eucalyptus. These results were also confirmed by the proteomic analysis of the cambial region of 3- and 22-year-old E. grandis trees by 2-DE and LC-MS/MS, showing that at least two isoforms are present. The cloned gene is mainly expressed in roots, stem and bark of 6-month-old saplings, with a lower expression in leaves. High expression levels were also observed in the cambial region of 3- and 22-year-old trees. The results described in this paper provide a further view of the hemicellulose biosynthesis during wood formation in E. grandis