Mécanismes d'activation et interactions fonctionnelles hétérologues des récepteurs aux chimiokines

Mécanismes d’activation et conséquences fonctionnelles de la dimérisation des récepteurs aux chimiokinesLes chimiokines sont de petites protéines qui régulent la migration des cellules immunitaires. Elles exercent leur action en se liant à des récepteurs appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dont la fonction est intimement liée à la régulation des cellules immunitaires. Notre laboratoire étudie depuis plusieurs années les relations reliant la structure et la fonction des récepteurs aux chimiokines. Ces dernières années, un nouveau concept est venu révolutionner le mode de fonctionnement des RCPGs. En effet, des travaux ont montré que la plupart des RCPGs sont capables de former des dimères. Le but de cette thèse de doctorat est d’étudier de manière systématique la dimérisation des récepteurs aux chimiokines et d’analyser les conséquences fonctionnelles de la dimérisation. Dimérisation des récepteurs humains aux chimiokines et conséquences fonctionnellesEn utilisant une technique biophysique basée sur un transfert d’énergie de luminescence (BRET) nous avons montré au cours de ce travail de thèse que les récepteurs CCR1, CCR2, CCR5, CCR7 et CXCR4 sont capables de former des homodimères et des hétérodimères. De plus, une dimérisation entre ChemR23, dont le ligand naturel, la chémérine, est structurellement différent des chimiokines, et les récepteurs CCR7 et CXCR4, a également été identifiée. D’un point de vue fonctionnel, des expériences réalisées au laboratoire dans le cadre d’un autre travail de thèse ont identifié une forme de compétition croisée entre CCR2, CCR5 et CXCR4 où la liaison de ligands (agonistes ou antagonistes) spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre. Ces effets ont été démontrés sur des cellules recombinantes mais aussi sur des cellules immunes et dans un modèle in vivo. (El-Asmar, 2005; Springael, 2006; Sohy, 2007; Sohy, 2009). Au cours de ce travail, nous nous sommes dans un premier temps focalisés sur les hétéromères de ChemR23 avec CXCR4 et CCR7 et nous avons ensuite étudié plus en profondeur les hétéromères de CCR7. Concernant la dimérisation de ChemR23 avec les récepteurs aux chimiokines CCR7 et CXCR4, nous avons pu mettre en évidence une coopérativité négative de liaison entre les agonistes des récepteurs comme cela avait pu être démontré pour CCR2/CCR5/CXCR4. Par contre, nous n’avons observé aucun effet de compétition hétérologue ou d’inhibition fonctionnelle croisée de l’AMD3100 sur ChemR23 quand il est coexprimé avec CXCR4. De manière additionnelle, nous avons pu observer cette compétition croisée sur des cellules dendritiques murines immatures, démontrant l’existence des effets de l’hétérodimérisation lorsque les récepteurs sont exprimés à un niveau physiologique. Lors de l’étude approfondie des hétéromères de CCR7, nous avons montré que les conséquences fonctionnelles de l’hétérodimérisation de CCR7 sont différentes suivant le récepteur avec lequel il interagit. Pour l’hétérodimère CCR7/CCR2, nous avons identifié une forme de compétition croisée, où la liaison de ligands spécifiques de l'un des deux récepteurs inhibe la liaison des ligands spécifiques de l’autre, rejoignant les effets mis en évidence pour les hétéromères CCR2/CCR5/CXCR4. Ensuite, nous avons montré pour l’hétérodimère CCR7/CCR5 que les ligands de CCR7 sont capables d’inhiber la liaison des ligands spécifiques sur CCR5 mais que l’inverse n’est pas vrai. Enfin, pour l’hétérodimère CCR7/CXCR4, nous n’avons pas pu mettre en évidence d’inhibition croisée, que ce soit dans un sens ou dans l’autre. D’autre part, un effet inhibiteur de CCR7 a également été identifié pour les hétéromères CCR7/CCR5 et CCR7/CXCR4. Nous avons pu montrer que l’expression de CCR7 exerce un effet négatif sur la réponse fonctionnelle de certains récepteurs hétérologues comme CCR5 et CXCR4 mais pas CCR2 ou ChemR23.L’ensemble de ces données permet de mieux comprendre les interactions entre récepteurs et pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles pour les programmes de recherche de molécules thérapeutiques, qui, jusqu’à présent, ciblaient presque exclusivement un seul et unique récepteur.Etude du mécanisme d’activation du récepteur CCR5 et étude de la relation entre activité constitutive et dimérisation.De nombreux travaux ont été menés ces dernières années afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à la base de l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Il apparaît que les RCPGs peuvent se trouver dans plusieurs états conformationnels, dont certains sont favorisés par la présence d’agonistes ou d’antagonistes, ou encore d’anticorps reconnaissant des épitopes conformationnels. Certaines mutations peuvent également induire la stabilisation de certaines conformations, actives ou inactives. Pour les RCPGs appartenant à la famille de la rhodopsine, il en a résulté un modèle selon lequel les récepteurs sont maintenus dans une conformation inactive par un ensemble d’interactions ioniques impliquant l’arginine (R3.50) d’un motif DRY conservé, présent à l’extrémité cytosolique du troisième segment transmembranaire. Les interactions responsables de ce qu’on appelle le « DRY-lock » feraient intervenir notamment l’aspartate (D3.49) adjacent de l’arginine et un aspartate ou glutamate (D/E6.30) localisé au sein de l’hélice 6. Selon ce modèle, la liaison d’un agoniste, ainsi que certaines mutations, favoriseraient la rupture de ces interactions ioniques, et une conformation permettant aux récepteurs de se coupler plus efficacement aux protéines G. Des résultats du laboratoire indiquent cependant que ce modèle ne serait pas transposable complètement au récepteur CCR5. CCR5 possède intrinsèquement une activité constitutive en absence d'agoniste. Cette activité peut être mise en évidence par l'action d'un des antagonistes de CCR5, le TAK-779, qui s'est révélé posséder une activité de type agoniste inverse. D'autre part, CCR5 possède au sein de l'hélice 6 une arginine en position 6.30 et non pas un glutamate ou un aspartate. Une arginine à cette position ne peut donc contribuer au maintien d’une conformation inactive par interaction avec R3.50 .Dans le but de tester le modèle de « DRY-lock » sur CCR5 et de mieux comprendre les interactions moléculaires impliquées dans l’activation du récepteur, plusieurs récepteurs mutants ont été construits au laboratoire. Tout d’abord, l’arginine 3.50 du motif DRY a été mutée en Asn (R3.50N) afin de rompre les interactions ioniques de ce résidu. L’aspartate 3.49 a été muté en Asn (D3.49N) ou en Val (D3.49V), afin de neutraliser une des interactions du « DRY-lock » (Lagane, 2005). L’arginine 6.30 a été mutée d’une part en Asp (R6.30D) ou en Glu (R6.30E), afin de rétablir une possibilité d’interaction avec R3.50, d’autre part en Ala (R6.30A) et en Gln (R6.30Q) afin de mieux cerner le rôle de la charge de l’arginine. Afin de tester l’hypothèse d’interaction entre le résidu 6.30 et le résidu 2.40, l’aspartate 2 .40 a été mutée en Ala (D2.40A) ou en Arg (D2.40R) et des récepteurs présentant les deux mutations ont également construits (D2.40A/R6.30A et D2.40R/R6.30D). L’ensemble des résultats obtenus par l’analyse de ces mutants a permis de montrer que la nature des interactions entre l’extrémité cytosolique des hélices 3 et 6 influence l’activité du récepteur CCR5 (Springael, 2007). Une interaction forte conduit à une forme de récepteur inactif alors qu’une interaction faible s’accompagne d’une augmentation d’activité constitutive. Cette propriété de CCR5 serait donc partagée avec d’autres récepteurs appartenant à la famille de la rhodopsine. Cependant les interactions inter-hélice stabilisant ces conformations seraient différentes pour CCR5. D’autre part, l’étude de la position 2.40 laisse supposer l'importance du résidu aspartate 2.40 dans le maintien d'une conformation permettant l'activité constitutive du récepteur. Nous avons également testé s’il existait une corrélation entre activité constitutive et capacité du récepteur CCR5 à former des dimères, mais les résultats ne nous ont pas permis de mettre en évidence une quelconque relation entre activité et dimérisation. Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiquesinfo:eu-repo/semantics/nonPublishe

Studies into chemokine receptor dimerization

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Stidues into chemokine receptors dimerization

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The Belgian PCB/dioxin incident: analysis of the food chain contamination and health risk evaluation.

The Belgian PCB incident occurred at the end of January 1999 when a mixture of polychlorinated biphenyls (PCBs) contaminated with dioxins was accidentally added to a stock of recycled fat used in the production of animal feeds. Although signs of poultry poisoning were noticed by February, 1999, the source and the extent of the contamination were discovered only in May 1999, when it appeared that more than 2500 farms could have been supplied with contaminated feeds. This resulted in a major food crisis, which rapidly extended to the whole country and could be resolved only by the implementation of a large PCB/dioxin food monitoring program. Screening for PCB contamination was based on the determination of the seven PCB markers. When PCB concentrations exceeded the tolerance levels of 0.1 (milk), 0.2 (poultry, bovine, and pig meat), or 1 (animal feed) microg/g fat, dioxins (17 PCDD/Fs congeners) were also determined. At the end of December 1999, the database contained the results of more than 55,000 PCB and 500 dioxin analyses. The study of PCB levels and profiles in contaminated feeds delivered to poultry or pig farms confirmed that the Belgian PCB incident was due to a single source of PCB oil introduced into the food chain at the end of January 1999. This PCB oil had a congeners pattern closely matched to a mixture of Aroclor 1260/1254 in the proportion 75/25. The total amount of PCBs added to recycled fats was estimated at 50 kg (sum of the seven markers) or approximately 150 kg total PCBs, which corresponds to about 100 liters of PCB oil. This PCB mixture contained about 1g TEQ dioxins (more than 90- contributed by PCDFs) and about 2g TEQ dioxin-like PCBs. The proportions of PCB 52 and 101 congeners were fairly constant in animal feeds, excluding the possibility of secondary contamination due to fat recycling from contaminated animals. The highest concentrations of PCBs and dioxins were found in poultry and especially in the reproduction animals (hens and chicks), which showed the classical manifestations of chick edema disease. The pigs were also affected but to a lesser extent and no sign of intoxication was observed. The study of PCB/dioxin patterns and of the PCB:dioxin ratios revealed major differences in the metabolism of these compounds by farm animals. Whereas the PCBs:dioxins ratio was fairly constant in all poultry products with a mean value similar to that found in contaminated feeds (50,000), in pigs this ratio was both much higher and more variable (values up to 10,000,000), reflecting a faster elimination of dioxins than PCBs in these animals. These metabolic differences also emerged from the PCB and dioxin patterns which were altered much more in pigs than in poultry. Although the most contaminated food products (chicken meat) had PCB and dioxin levels more than 100 times above maximal recommended values, it is unlikely that this incident could have caused adverse effects in the general population of Belgium. A doubling of the PCB and dioxin burden of the young adult population would require the consumption of, respectively, 10 and 20 highly contaminated meals. In view of the very limited proportion of the poultry chain effectively contaminated during the incident (around 2%), such an extreme scenario was quite improbable for the general population except perhaps for farmers consuming their own products. But even in that case, it would have meant going back to the levels in the 1980s or attaining the body burden of subjects regularly eating contaminated seafood

Chemokine receptor CCR7 controls CXCR4 responsiveness during B cells development

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Coexpression of CCR7 and CXCR4 During B Cell Development Controls CXCR4 Responsiveness and Bone Marrow Homing.

The CXCL12-CXCR4 axis plays a key role in the retention of stem cells and progenitors in dedicated bone marrow niches. It is well-known that CXCR4 responsiveness in B lymphocytes decreases dramatically during the final stages of their development in the bone marrow. However, the molecular mechanism underlying this regulation and whether it plays a role in B-cell homeostasis remain unknown. In the present study, we show that the differentiation of pre-B cells into immature and mature B cells is accompanied by modifications to the relative expression of chemokine receptors, with a two-fold downregulation of CXCR4 and upregulation of CCR7. We demonstrate that expression of CCR7 in B cells is involved in the selective inactivation of CXCR4, and that mature B cells from CCR7-/- mice display higher responsiveness to CXCL12 and improved retention in the bone marrow. We also provide molecular evidence supporting a model in which upregulation of CCR7 favors the formation of CXCR4-CCR7 heteromers, wherein CXCR4 is selectively impaired in its ability to activate certain G-protein complexes. Collectively, our results demonstrate that CCR7 behaves as a novel selective endogenous allosteric modulator of CXCR4.info:eu-repo/semantics/publishe

Upregulation of chemokine receptor CCR7 during B cell development controls CXCR4 responsiveness and bone marrow homing

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The activation mechanism of chemokine receptor CCR5 involves common structural changes but a different network of interhelical interactions relative to rhodopsin.

In G protein-coupled receptors (GPCRs), the interaction between the cytosolic ends of transmembrane helix 3 (TM3) and TM6 was shown to play an important role in the transition from inactive to active states. According to the currently prevailing model, constructed for rhodopsin and structurally related receptors, the arginine of the conserved "DRY" motif located at the cytosolic end of TM3 (R3.50) would interact with acidic residues in TM3 (D/E3.49) and TM6 (D/E6.30) at the resting state and shift out of this polar pocket upon agonist stimulation. However, 30% of GPCRs, including all chemokine receptors, contain a positively charged residue at position 6.30 which does not support an interaction with R3.50. We have investigated the role of R6.30 in this receptor family by using CCR5 as a model. R6.30D and R6.30E substitutions, which allow an ionic interaction with R3.50, resulted in an almost silent receptor devoid of constitutive activity and strongly impaired in its ability to bind chemokines but still able to internalize. R6.30A and R6.30Q substitutions, allowing weaker interactions with R3.50, preserved chemokine binding but reduced the constitutive activity and the functional response to chemokines. These results indicate that the constitutive and ligand-promoted activity of CCR5 can be modified by modulating the interaction between the DRY motif in TM3 and residues in TM6 suggesting that the overall structure and activation mechanism are well conserved in GPCRs. However, the molecular interactions locking the inactive state must be different in receptors devoid of D/E6.30.Journal ArticleResearch Support, Non-U.S. Gov'tinfo:eu-repo/semantics/publishe

Coexpression of CCR7 and CXCR4 during B cells development controls CXCR4 responsiveness and bone marrow homi

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