Etude des marqueurs de virulence de Trichophyton benhamiae sur modèle d'infection cutanée murin optimisé

Les dermatophytoses sont des mycoses cutanées superficielles observées aussi bien chez l’homme que chez l’animal causées par des champignons filamenteux appelés dermatophytes. Les dermatophytoses humaines sont très répandues et le plus souvent provoquées par des espèces appartenant au genre Trichophyton. L’émergence croissante de souches résistantes aux antifongiques actuellement disponible et l’absence de vaccins à usage humain soulignent la nécessité de développer de nouveaux traitements. Dans ce cadre, l’accroissement des connaissances relatives à la pathogénie des dermatophytoses, y compris la caractérisation des facteurs de virulence fongiques sur modèle animal, constitue une étape clé pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Une méthode de standardisation de la production de spores de dermatophytes pour réaliser des inoculations in vitro et in vivo a récemment été publiée par notre équipe de recherche (Faway et al., 2021). Si cette méthode basée sur l’utilisation de suspensions enrichies en spores unicellulaires permet le développement d’infections standardisées sur épidermes humains reconstruits in vitro, elle n’est pas optimale pour la réalisation d’infections in vivo chez la souris. L’objectif de cette étude consiste par conséquent à (1) analyser des gènes codant pour des facteurs de virulence supposés tels que les subtilisines, ainsi qu’à (2) produire et valider un inoculum standardisé permettant d’obtenir des infections cutanées exploitables sur modèle murin, avec la souche de référence Trichophyton benhamiae IHEM 20161. Grâce à un tBLASTn et une analyse bio-informatique, l’ensemble des 12 gènes codant pour les subtilisines connues chez les dermatophytes (Monod, 2008) a été identifié au sein du génome de T. benhamiae IHEM 20161. Pour évaluer l’implication de ces subtilisines dans l’infection, la souche T. benhamiae IHEM 20161 délétée au locus Ku70 (gène impliqué dans le système de réparation de l’ADN) a été utilisée pour produire six souches mutées au niveau d’une ou plusieurs subtilisines d’intérêt (∆Sub6 ; ∆Sub7 ; ∆Sub8 ; ∆Sub10 ; ∆Sub6.∆Sub10 et ∆Sub6.∆Sub8.∆Sub10). Ces différentes souches ont été testées dans un nouveau modèle d’infection épicutanée chez la souris, en utilisant un mélange de spores (1.108 UFC), de tubes germinatifs et de mycélium (100 mg). Un suivi cinétique de l’infection a été réalisé de manière quotidienne via l’établissement d’un score clinique global basé sur l’intensité (0→4) de trois types de signes cliniques cutanés (érythème, squames, croûtes). Comparativement à une infection classique (inoculum ne contenant que des spores), ce nouveau modèle d’infection génère des lésions cutanées plus importantes et davantage persistantes (signes cliniques minimes jusqu’au 7ième jour post-infection avec les spores seules vs symptômes mimant une infection naturelle jusqu’au 16ième jour post-infection pour le mélange spores/tubes germinatifs/mycélium). En outre, l’analyse des résultats préliminaires indique que certaines souches invalidées pour une ou plusieurs subtilisines induisent des symptômes cutanés plus intenses, témoignant de leur importance dans la régulation et/ou le maintien de l’infection sur modèle murin. Prochainement, une deuxième expérience d’infection sur modèle murin consistera à réaliser des biopsies à des temps clés de l’infection pour (1) évaluer l’invasion des tissus cutanés par analyse histologique, (2) déterminer la charge fongique présente dans les tissus par quantification d’ADN génomique et (3) caractériser l’expression des subtilisines par PCR quantitative

Towards a Standardized Procedure for the Production of Infective Spores to Study the Pathogenesis of Dermatophytosis

Dermatophytoses are superficial infections of human and animal keratinized tissues caused by filamentous fungi named dermatophytes. Because of a high and increasing incidence, as well as the emergence of antifungal resistance, a better understanding of mechanisms involved in adhesion and invasion by dermatophytes is required for the further development of new therapeutic strategies. In the last years, several in vitro and in vivo models have emerged to study dermatophytosis pathogenesis. However, the procedures used for the growth of fungi are quite different, leading to a highly variable composition of inoculum for these models (microconidia, arthroconidia, hyphae), thus rendering difficult the global interpretation of observations. We hereby optimized growth conditions, including medium, temperature, atmosphere, and duration of culture, to improve the sporulation and viability and to favour the production of arthroconidia of several dermatophyte species, including Trichophyton rubrum and Trichophyton benhamiae. The resulting suspensions were then used as inoculum to infect reconstructed human epidermis in order to validate their ability to adhere to and to invade host tissues. By this way, this paper provides recommendations for dermatophytes culture and paves the way towards a standardized procedure for the production of infective spores usable in in vitro and in vivo experimental models