Efecto protector del azul de metileno en la retinopatía del prematuro experimental

Introducción: La hipoxia-isquemia por asfixia perinatal (AP) es causa de lesiones en la retina, pudiendo llevar a la ceguera por retinopatía proliferativa isquémica (RPI). En estudios previos hemos demostrado neurodegeneración, gliosis y neovascularización compatibles con la ROP, e identificado que el sistema nitrérgico está involucrado en su fisiopatología. Objetivos: Analizar la aplicación de azul de metileno como potencial estrategia terapéutica, dado que inhibe a la enzima óxido nítrico sintasa. Métodos: Se estudió la actividad enzimática y expresión de nNOS mediante Western blot, histoquímica de NADPHd e inmunohistoquímica contra nNOS, en la retina de animales de 30 días en un modelo de AP. Resultados: Se observó que a los 30 días postnatal, la nNOS aumenta significativamente su actividad y expresión en aquellos animales sometidos a AP al ser comparados con el grupo control (CTL). En el grupo AP tratado con azul de metileno (AZM) no se encontraron diferencias significativas en la actividad de NOS constitutiva con respecto al grupo CTL, mientras que su expresión evaluada por western blot fue menor. Los estudios realizados con histoquímica para NADPHd e inmunohistoquímica contra nNOS refuerzan estos resultados. Conclusiones: El NO es un radical libre que participa como neurotóxico en el desarrollo de la ROP por AP. La aplicación de azul de metileno como estrategia terapéutica, tiene un potente efecto bloqueante en la actividad de la enzima NOS constitutiva, y en la expresión de la misma. Este hallazgo alienta estudios futuros más exhaustivos para evaluar el uso del azul de metileno con el fin de atenuar o evitar el daño retiniano.Introduction: Hipoxia-ischemia by perinatal asphyxia (PA) is cause of retinal lesions, and can produce blindness by ischemic proliferative retinopathy (IPR). Previously, we have demonstrated retinal neurodegeneration, gliosis and neovascularization. Furthermore, we have identified the involvement of the nitregic system in it physiopatology. Objectives: Studying the participation of nitric oxide (NO) through the neuronal isoform of the enzyme nitric oxide sinthase (nNO) as trigger of the structural and molecular alterations previously observed by our group of research, and analyzing the application of methylene blue (MB) a therapeutic strategy. Methods: The studies were performed in retina by using enzymatic activity, NADPHd histochemical method and immunohistochemistry against nNOS. The studies were applied in three diferent groups (control, PA and MB) of 30 postnatal day animals. Results: At 30 postnatal day, we observed a significant increase of nNOS ativity and expression in retinas of those animals subjected to PA, when compared with the control group. In the group treated with methylene blue we did not found significant diferences in constitutive NOS activity, meanwhile it expression evaluated by western blot was lower than controls. The histochemical and immunohistochemical studies support these results. Conclusions: NO, is a free radical that act as a neurotoxic agent, seems to have a crucial role in the development of ROP after PA. The application of methylene blue as a therapeutic strategy showed a strong protective efect inhibiting the constitutive NOS activity and it expression. This founds stimulates future studies with the aim of using MB in order to avoid or decrease retinal damage.Fil: Rey Funes, Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Fernández, J. C.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Cátedra de Farmacología; ArgentinaFil: Ibarra, Mariano Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Peña, Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Contartese, Daniela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Inserra, Pablo Ignacio Felipe. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico; ArgentinaFil: López, Juan José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Dorfman, Verónica Berta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Loidl, Cesar Fabian. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Expression of Cold-Inducible Proteins in Rat Spinal Cord Subjected to Systemic Hypothermia

Introducción: La lesión traumática de la médula espinal es la principal causa de discapacidad motora en el mundo, y representa una prioridad para la Organización Mundial de la Salud. Se estudió, a nivel estructural y bioquímico, el efecto de la hipotermia sobre la expresión de la CIRBP (proteína activada por frío) en el asta anterior de la médula de ratas Sprague-Dawley albinas macho de 60 días, planteándola como terapéutica posible. Materiales y Métodos: Se dividió a 24 ratas en dos grupos: normotermia a 24 °C (n = 6) e hipotermia a 8 °C (n = 18), durante 180 min, sacrificadas a las 12, 24 y 48 h después del tratamiento. Se utilizó Western blot e inmunohistoquímica para la CIRBP. Resultados: Se observó un aumento progresivo de la expresión de la CIRBP de 12 a 48 h en las motoneuronas del asta anterior. Los valores fueron estadísticamente significativos entre los grupos de 24 h y 48 h comparados con los de los controles. Conclusiones: Este modelo experimental resultó eficaz, accesible y económico para generar hipotermia sistémica y abre un abanico de estrategias terapéuticas. El aumento en la expresión de las proteínas inducibles por frío en la médula espinal de ratas permite, por primera vez, estudiar el beneficio que aporta la hipotermia a nivel molecular, lo que resulta de suma importancia para estudios de terapéuticas en las lesiones medulares.Introduction: Traumatic spinal cord injury is the main cause of motor disability in developed and underdeveloped countries, being a priority interest to the WHO. The effect of hypothermia on the expression of CIRBP (cold-activated protein) in the anterior grey column of 60-day-old male albino Sprague-Dawley rats was studied at the structural and biochemical levels and proposed as a possible therapeutic approach. Materials and Methods: 24 rats were randomly divided into two groups; normothermia (n = 6), at 24° C, and hypothermia, (n = 18) at 8° C for 180 minutes and euthanized at 12, 24, and 48 h post-treatment. Western blot and immunohistochemistry for CIRBP were used. Results: A progressive increase in the expression of CIRBP was observed from 12 to 48 hours, with statistically significant values after 24 and 48 hours compared to controls. Conclusion: This experimental model demonstrated efficacy, accessibility, and economy to generate systemic hypothermia, which provides a novel range of therapeutic strategies. The increase in the expression of cold-inducible proteins in the rats’ spinal cords allows us to study the benefit of hypothermia at the molecular level for the first time, being of utmost importance for therapeutic studies in spinal cord injuries.Fil: Sarotto, Aníbal José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Rey Funes, Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Dorfman, Verónica Berta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico; ArgentinaFil: Contartese, Daniela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Larráyoz, Ignacio M.. Center for Biomedical Research of La Rioja; EspañaFil: Martínez, Alfredo. Center for Biomedical Research of La Rioja; EspañaFil: Toscanini, María Agustina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Loidl, Cesar Fabian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; Argentin

Hypothermia prevents gliosis and angiogenesis development in an experimental model of ischemic proliferative retinopathy

PURPOSE: To develop a time course study of vascularization and glial response to perinatal asphyxia in hypoxic-ischemic animals, and to evaluate hypothermia as possible protective treatment. METHODS: We used retinas of 7-, 15-, 21-, and 30-day-old male Sprague-Dawley rats that were exposed to perinatal asphyxia at either 37°C (PA) or 15°C (HYP). Born to term animals were used as controls (CTL). We evaluated the thickness of the most inner layers of the retina (IR), including internal limiting membrane, the retinal nerve fiber layer, and the ganglion cell layer; and studied glial development, neovascularization, adrenomedullin (AM), and VEGF by immunohistochemistry, immunofluorescence, and Western blot. RESULTS: A significant increment in IR thickness was observed in the PA group from postnatal day (PND) 15 on. This alteration was concordant with an increased number of new vessels and increased GFAP expression. The immunolocalization of GFAP in the internal limiting membrane and perivascular glia of the IR and in the inner processes of Müller cells was coexpressed with AM, which was also significantly increased from PND7 in PA animals. In addition, VEGF expression was immunolocalized in cells of the ganglion cell layer of the IR and this expression significantly increased in the PA group from PND15 on. The retinas of the HYP group did not show differences when compared with CTL at any age. CONCLUSIONS: This work demonstrates that aberrant angiogenesis and exacerbated gliosis seem to be responsible for the increased thickness of the inner retina as a consequence of perinatal asphyxia, and that hypothermia is able to prevent these alterations.Fil: Rey Funes, Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; ArgentinaFil: Dorfman, Verónica Berta. Universidad Maimónides. Area de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Ibarra, Mariano Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; ArgentinaFil: Peña, Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; ArgentinaFil: Contartese, Daniela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; ArgentinaFil: Goldstein Raij, Jorge. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Ciencias Fisiológicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Acosta, Juan Manuel. Universidad Católica de Cuyo - Sede San Juan. Facultad de Ciencias Médicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Larráyoz, Ignacio M.. Centro de Investigación Biomédica de La Rioja; EspañaFil: Martínez Murillo, Ricardo. Consejo Superior de Investigaciones Cientificas; España. Instituto Cajal. Departamento de Neurobiología Molecular, Celular y del Desarrollo; EspañaFil: Martínez, Alfredo. Centro de Investigación Biomédica de La Rioja; España. Consejo Superior de Investigaciones Cientificas; EspañaFil: Loidl, Cesar Fabian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; Argentina. Universidad Católica de Cuyo - Sede San Juan. Facultad de Ciencias Médicas; Argentin

Methylene blue prevents retinal damage in an experimental model of ischemic proliferative retinopathy

Perinatal asphyxia induces retinal lesions, generating ischemic proliferative retinopathy, which may result in blindness. Previously, we showed that the nitrergic system was involved in the physiopathology of perinatal asphyxia. Here we analyze the application of methylene blue, a well-known soluble guanylate cyclase inhibitor, as a therapeutic strategy to prevent retinopathy. Male rats (n = 28 per group) were treated in different ways: 1) control group comprised born-to-term animals; 2) methylene blue group comprised animals born from pregnant rats treated with methylene blue (2 mg/kg) 30 and 5 min before delivery; 3) perinatal asphyxia (PA) group comprised rats exposed to perinatal asphyxia (20 min at 37°C); and 4) methylene blue-PA group comprised animals born from pregnant rats treated with methylene blue (2 mg/kg) 30 and 5 min before delivery, and then the pups were subjected to PA as above. For molecular studies, mRNA was obtained at different times after asphyxia, and tissue was collected at 30 days for morphological and biochemical analysis. Perinatal asphyxia produced significant gliosis, angiogenesis, and thickening of the inner retina. Methylene blue treatment reduced these parameters. Perinatal asphyxia resulted in a significant elevation of the nitrergic system as shown by NO synthase (NOS) activity assays, Western blotting, and (immuno)histochemistry for the neuronal isoform of NOS and NADPH-diaphorase activity. All these parameters were also normalized by the treatment. In addition, methylene blue induced the upregulation of the anti-angiogenic peptide, pigment epithelium-derived factor. Application of methylene blue reduced morphological and biochemical parameters of retinopathy. This finding suggests the use of methylene blue as a new treatment to prevent or decrease retinal damage in the context of ischemic proliferative retinopathy.Fil: Rey Funes, Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; ArgentinaFil: Larráyoz, Ignacio M.. Angiogenesis Study Group. Center for Biomedical Research of La Rioja; EspañaFil: Fernández, Juan C.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Cátedra de Farmacología; ArgentinaFil: Contartese, Daniela Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; ArgentinaFil: Rolón, Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; ArgentinaFil: Inserra, Pablo Ignacio Felipe. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico. Departamento de Estudios Biomédicos y Biotecnológicos; ArgentinaFil: Martínez Murillo, Ricardo. Consejo Superior de Investigaciones Científicas; EspañaFil: López, Juan José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; ArgentinaFil: Dorfman, Verónica Berta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico. Departamento de Estudios Biomédicos y Biotecnológicos; ArgentinaFil: Martínez, Alfredo. Angiogenesis Study Group. Center for Biomedical Research of La Rioja; EspañaFil: Loidl, Cesar Fabian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; Argentina. Universidad Católica de Cuyo - Sede San Juan. Facultad de Ciencias Médicas. Departamento de Neurociencia; Argentin

Hypothermic shock applied after perinatal asphyxia prevents retinal damage in rats

Perinatal asphyxia (PA) can cause retinopathy and different degrees of visual loss, including total blindness. In a rat model of PA, we have previously shown a protective effect of hypothermia on the retina when applied simultaneously with the hypoxic insult. In the present work, we evaluated the possible protective effect of hypothermia on the retina of PA rats when applied immediately after delivery. Four experimental groups were studied: Rats born naturally as controls (CTL), animals that were exposed to PA for 20 min at 37°C (PA), animals exposed to PA for 20 min at 15°C (HYP), and animals that were exposed to PA for 20 min at 37°C and, immediately after birth, kept for 15 min at 8°C (HYP-PA). To evaluate the integrity of the visual pathway, animals were subjected to electroretinography at 45 days of age. Molecular (real time PCR) and histological (immunohistochemistry, immunofluorescence, TUNEL assay) techniques were applied to the eyes of all experimental groups collected at 6, 12, 24, and 48 h, and 6 days after birth. PA resulted in a significant reduction in the amplitude of the a- and b-wave and oscillatory potentials (OP) of the electroretinogram. All animals treated with hypothermia had a significant correction of the a-wave and OP, but the b-wave was fully corrected in the HYP group but only partially in the HYP-PA group. The number of TUNEL-positive cells increased sharply in the ganglion cell layer of the PA animals and this increase was significantly prevented by both hypothermia treatments. Expression of the cold-shock proteins, cold-inducible RNA binding protein (CIRP) and RNA binding motif protein 3 (RBM3), was undetectable in retinas of the CTL and PA groups, but they were highly expressed in ganglion neurons and cells of the inner nuclear layer of the HYP and HYP-PA groups. In conclusion, our results suggest that a post-partum hypothermic shock could represent a useful and affordable method to prevent asphyxia-related vision disabling sequelae.Fil: Rey Funes, Manuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencias; ArgentinaFil: Contartese, Daniela Soledad. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencias; ArgentinaFil: Peláez, Rafael. Centro de Investigación Biomédica de La Rioja; EspañaFil: García Sanmartín, Josune. Centro de Investigación Biomédica de La Rioja; EspañaFil: Narro Íñiguez, Judit. Centro de Investigación Biomédica de La Rioja; EspañaFil: Soliño, Manuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencias; ArgentinaFil: Fernández, Juan Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencias; ArgentinaFil: Sarotto, Aníbal José. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencias; ArgentinaFil: Ciranna, Nicolás S.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencias; ArgentinaFil: López Costa, Juan José. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencias; ArgentinaFil: Dorfman, Verónica Berta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Maimónides. Área de Investigaciones Biomédicas y Biotecnológicas. Centro de Estudios Biomédicos, Biotecnológicos, Ambientales y de Diagnóstico; ArgentinaFil: Larráyoz, Ignacio M.. Centro de Investigación Biomédica de La Rioja; EspañaFil: Loidl, C. Fabián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencias; ArgentinaFil: Martínez, Alfredo. Centro de Investigación Biomédica de La Rioja; Españ