Development of quantitative functional analysis tools and models for neuroscientific applications

Background and goals The growing complexity of biological data requires researchers to develop methods to manage and analyze these data. Modelling and predicting complex systems has become increasingly important. The goal of my work was to develop bioinformatic tools and models for neuroscientific applications. In this work I developed two analysis tools and two models for different applications: In many basic studies, healthy neuronal function is ensured by assessing immunochemical stainings or unspecific cell viability assays. We sought out to broaden the experimental repertoire by a quantitative, functional analysis of neuronal function. As synaptic vesicle pool sizes are highly regulated and sensitive to disturbances, we used them as a marker of healthy neuronal function in our study on chemotherapeutic drug candidates. We found that synaptic vesicle pools were modified at drug concentrations so low that effects were too faint to be detected with other common experimental assays. With the development of a quantitative, functional analysis tool we were also able to expand the common experimental methods in a study on epigenetic modifications in epilepsy. We used an in vitro model for epileptogenesis and were able to directly relate alterations in gene-expression patterns, DNA methylation and epigenetic histone marks to pro-epileptogenic neuronal firing behavior. Apart from functional analyses, the prediction and modelling of complex systems is an important part of bioinformatics. We developed a model to project three-dimensional MR imaging data of stroke patients to two-dimensional maps. This dimensionality reduction was a first step towards a future extension of the model to correlate MR imaging data with EEG data and ultimately to develop an automated stroke detection based on only EEG data. The model was able to accurately represent stroke localizations and can be applied also in studies on brain-wide connectivity. Connectivity alterations during a stroke can be modeled on different scales. In an effort to develop a complete pipeline for connectivity analysis in vitro, we investigated neuronal connectivity on a single-cell level. We used the developed and validated method to measure the effect of a blockage of neuronal activity on the neurons’ connectivity. Next to the hypothesized strengthening of connections between neurons during activity silencing we also found an extensive ramification of the silenced neuronal networks. Methods The developed analysis tools and models shared a common backbone: First, the imaging data had to be pre-processed and segmented. Then neuronal activity traces were extracted from the data. In some applications this step was followed by the detection of neuronal firing events in the activity traces. Finally, neuronal activity was analyzed to answer the specific research question. Depending on the size and contrast of the targeted regions of interest I used different image segmentation approaches. A filtering of the image with a Laplacian kernel was used to detect edges around small regions of interest such as synapses. Bigger, evenly bright regions such as cell bodies in calcium imaging were detected with a feature point detection algorithm. Stroke, healthy brain and background were distinguished in MR images using background-determination based detection. To detect neuronal firing events in fluorescence traces, I used a simple thresholding algorithm to distinguish between independent spiking behavior and bursting. A more accurate estimation of underlying action potentials was obtained from parsing neuronal fluorescence traces with a template fitting peeling algorithm. When analyzing connectivity I used several different algorithms to infer connectivity from neuronal activity data. Networks recorded under different conditions were compared and the graphtheoretical features of the resulting networks were analyzed. Results With the developed analysis tools we were able to answer new research questions and further knowledge gain. The custom-tailored software allowed a detailed analysis of the experimental data and a quantitative functional analysis broadened the previously known experimental repertoire. The programmed scripts are included in the publications and can be used and adopted by researchers with similar applications. Conclusion Bioinformatic developments here and in many other applications are accelerating research in all fields. Especially in neuroscience, global initiatives like the Human Brain Project and the BRAIN Initiative focus such developments and will lead to new insight into the brain’s function. With works like this we all contribute to the advancement of neuroscience. Especially the investigation of neuronal connectivity offers a new approach to neuropsychiatric diseases and may be able to link complex cellular and molecular pathologies to global behavior.Hintergrund und Ziele Die wachsende Komplexität biologischer Daten erfordert von Wissenschaftlern die Entwicklung neuer Methoden, um diese Daten zu verwalten und zu analysieren. Die Modellierung und Vorhersage komplexer Systeme ist im Laufe der Zeit immer wichtiger geworden. Das Ziel meiner Arbeit bestand in der Entwicklung bioinformatischer Programme und Modelle für neurowissenschaftliche Anwendungen. In dieser Arbeit entwickelte ich hierfür zwei Analyseprogramme und zwei Modelle für verschiedene Anwendungen: In vielen grundlagenwissenschaftlichen Studien wird die gesunde neuronale Funktion allein durch die Betrachtung von immunchemischen Färbungen oder unspezifischen Zellviabilität-Assays sichergestellt. Wir haben das bestehende experimentelle Repertoire daher um eine quantitative und funktionelle Analyse der neuronalen Funktion ergänzt. Da die synaptischen Vesikelpools stark reguliert und sensitiv für Störungen sind, haben wir sie im Rahmen unserer Studie zu chemotherapeutischen Medikament-Kandidaten als Marker einer gesunden neuronalen Funktion verwendet. Wir fanden dabei heraus, dass die synaptischen Vesikelpools bei Medikament-Konzentrationen verändert waren, welche so niedrig waren, dass diese entstehenden funktionellen Veränderungen zu schwach waren, um mit den anderen üblichen Assays detektiert werden zu können. In einer Studie zu epigenetischen Modifikationen bei Epilepsie konnten wir mit der Entwicklung einer quantitativen und funktionellen Analyse ebenfalls das übliche experimentelle Repertoire erweitern. Wir verwendeten hierfür ein in vitro Modell für die Epileptogenese: In diesem Modell konnten wir eine direkte Verbindung zwischen Genexpressionsmustern, DNA-Methylierung und epigenetischen histonmodifikationen mit pro-epileptogenem, neuronalem Feuerverhalten zeigen. Neben funktionellen Analysen ist die Vorhersage und die Modellierung von komplexen Systemen ein wichtiger Teil der Bioinformatik. Wir entwickelten ein Modell zur Projektion dreidimensionaler MRT-Bildgebungsdaten von Schlaganfallpatienten zu zweidimensionalen Karten. Diese Dimensionsreduktion war ein erster Schritt für die zukünftige Erweiterung des Modells um die Korrelation von MRT-Daten und EEG-Daten von Schlaganfall-Patienten, und letztlich um die Entwicklung einer automatischen Schlaganfalldetektion, basierend allein auf EEG-Daten. Das neu entwickelte Projektions-Modell konnte die Lokalisation von Schlaganfällen akkurat repräsentieren, und kann für zukünftige weitere Studien zur Konnektivität im Gehirn angewendet werden. Konnektivitätsveränderungen während Schlaganfällen können auf verschiedenen Ebenen modelliert werden. Mit dem Ziel, eine gesamte Pipeline für in vitro Konnektivitätsmessungen zu entwickeln, untersuchten wir neuronale Konnektivität auf der Einzelzell-Ebene. Wir verwendeten eine von uns entwickelte und validierte Methode, um den Effekt der Blockade neuronaler Aktivität auf die Konnektivität von Neuronen zu messen. Wir konnten unsere Hypothese, dass während der Stilllegung der Aktivität die Verbindungen zwischen den Neuronen gestärkt werden, bestätigen, und fanden zusätzlich heraus, dass die Aktivitätsblockade eine weitreichende Verdichtung der neuronalen Netzwerke zur Folge hat. Methoden Die entwickelten Analyseprogramme und Modelle basierten auf einem gemeinsamen Grundgerüst: Zunächst mussten die Bildgebungsdaten vorbereitet und segmentiert werden. Dann wurden die Zeitserien neuronaler Aktivität extrahiert. In einigen der Anwendungen folgte auf diesen Schritt die Detektion neuronaler Feuerevents in den Aktivitätsspuren. Letztlich wurde die neuronale Aktivität analysiert, um die jeweilige Forschungsfragestellung zu beantworten. Abhängig von der Größe und dem Kontrast der angestrebten Regionen verwendete ich verschiedene Bildsegmentierungs-Ansätze. Ein Filtern der Bilder mit einem Laplace-Kern wurde verwendet, um die Ränder kleiner Regionen, z.B. Synapsen, zu detektieren. Größere und gleichmäßig helle Regionen, wie Zellkörper, wurden in Calcium-Imaging Daten mit einem feature point-Detektions-Algorithmus detektiert. In den MR-Bildern wurden Schlaganfallsgebiet, gesundes Gehirn und Hintergrund anhand eines background-determination based-Detektions-Algorithmus detektiert. Neuronale Aktivität wurde in den Fluoreszenzspuren mit verschiedenen Methoden detektiert: Ich verwendete einen einfachen Grenzwert-Algorithmus, um zwischen unabhängigem Feuern und Burstverhalten zu unterscheiden. Eine akkuratere Detektion der zu Grunde liegenden Aktionspotentiale erfolgte durch die Analyse neuronaler Fluoreszenzspuren durch Verwendung eines template fitting peeling-Algorithmus. Bei der Untersuchung von Konnektivität verwendete ich mehrere verschiedene Algorithmen, um die Konnektivität aus den neuronalen Aktivitätsdaten abzuleiten. Netzwerke, die unter verschiedenen Konditionen gemessen wurden, wurden verglichen. Zusätzlich wurden graphentheoretische Merkmale der Netzwerke analysiert. Ergebnisse und Beobachtungen Mit den entwickelten Analyseprogrammen konnten wir neue Forschungsfragen beantworten und zum Erkenntnisgewinn beitragen. Die spezifisch zugeschnittene Software ermöglichte eine detaillierte Analyse der experimentellen Daten, und die quantitative funktionelle Analyse erweiterte das bisherige experimentelle Spektrum. Die programmierten Skripte sind Teil der Publikationen und können von Wissenschaftlern mit ähnlichen Anwendungen verwendet und angepasst werden. Schlussfolgerungen Bioinformatische Entwicklungen hier und in vielen anderen Anwendungen beschleunigen die Wissenschaft in allen Bereichen. Besonders in den Neurowissenschaften fokussieren sich weltweite Initiativen wie das Human Brain Projekt und die BRAIN Initiative auf diese Entwicklungen und werden neuen Aufschluss über die Funktionen des Gehirns geben. Mit Arbeiten wie dieser tragen wir alle zur Weiterentwicklung der Neurowissenschaft bei. Besonders die Untersuchung von neuronaler Konnektivität bietet eine neue Herangehensweise an neuropsychiatrische Krankheiten und könnte eine Verbindung zwischen Komplexität von zellulärer und molekularer Pathologie und dem globalem Verhalten herstellen

Rewiring of neuronal networks during synaptic silencing

Analyzing the connectivity of neuronal networks, based on functional brain imaging data, has yielded new insight into brain circuitry, bringing functional and effective networks into the focus of interest for understanding complex neurological and psychiatric disorders. However, the analysis of network changes, based on the activity of individual neurons, is hindered by the lack of suitable meaningful and reproducible methodologies. Here, we used calcium imaging, statistical spike time analysis and a powerful classification model to reconstruct effective networks of primary rat hippocampal neurons in vitro. This method enables the calculation of network parameters, such as propagation probability, path length, and clustering behavior through the measurement of synaptic activity at the single-cell level, thus providing a fuller understanding of how changes at single synapses translate to an entire population of neurons. We demonstrate that our methodology can detect the known effects of drug-induced neuronal inactivity and can be used to investigate the extensive rewiring processes affecting population-wide connectivity patterns after periods of induced neuronal inactivity

Chemotherapeutic xCT inhibitors sorafenib and erastin unraveled with the synaptic optogenetic function analysis tool

In the search for new potential chemotherapeutics, the compounds’ toxicity to healthy cells is an important factor. The brain with its functional units, the neurons, is especially endangered during the radio- and chemotherapeutic treatment of brain tumors. The effect of the potential compounds not only on neuronal survival but also neuronal function needs to be taken into account. Therefore, in this study we aimed to comprehend the biological effects of chemotherapeutic xCT inhibition on healthy neuronal cells with our synaptic optogenetic function analysis tool (SOFA). We combined common approaches, such as investigation of morphological markers, neuronal function and cell metabolism. The glutamate-cystine exchanger xCT (SLC7A11, system Xc−) is the main glutamate exporter in malignant brain tumors and as such a relevant drug target for treating deadly glioblastomas (WHO grades III and IV). Recently, two small molecules termed sorafenib (Nexavar) and erastin have been found to efficiently block xCT function. We investigated neuronal morphology, metabolic secretome profiles, synaptic function and cell metabolism of primary hippocampal cultures (containing neurons and glial cells) treated with sorafenib and erastin in clinically relevant concentrations. We found that sorafenib severely damaged neurons already after 24 h of treatment. Noteworthy, also at a lower concentration, where no morphological damage or metabolic disturbance was monitored, sorafenib still interfered with synaptic and metabolic homeostasis. In contrast, erastin-treated neurons displayed mostly inconspicuous morphology and metabolic rates. Key parameters of proper neuronal function, such as synaptic vesicle pool sizes, were however disrupted following erastin application. In conclusion, our data revealed that while sorafenib and erastin effectively inhibited xCT function they also interfered with essential neuronal (synaptic) function. These findings highlight the particular importance of investigating the effects of potential neurooncological and general cancer chemotherapeutics also on healthy neuronal cells and their function as revealed by the SOFA tool