Characterization and expression of subtilases involved in grapevine resistance to Plasmopara viticola

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A videira (Vitis vinifera L.) é a planta de fruto mais cultivada em todo o mundo devido à sua importância económica na indústria vinícola. A sua área de cultivo mundial atinge os 7,5 milhões de hectares com uma produção de 75,8 milhões de toneladas em 2016, sendo a União Europeia líder na produção mundial de vinho (OIV, 2017). Atualmente, uma das grandes ameaças para a indústria vinícola é o míldio da videira, doença causada pelo oomycete obrigatório Plasmopara viticola que afeta todas as castas de Vitis vinifera frequentemente usadas na produção de vinho. No seu ciclo de vida, o P. viticola hiberna sob a forma de oósporos, estas estruturas são altamente resistentes às condições climáticas adversas, podendo conservar a sua vitalidade durante 2 anos. Sob condições adequadas (temperatura entre os 22-25ºC e humidade elevada) os oósporos germinam, dando origem a zoosporângios que libertam zoósporos que germinam e penetram através dos estomas. Na página superior da folha surgem manchas translúcidas e oleosas coincidentes com o aparecimento de um enfeltrado de micélio branco na página inferior levando ao aparecimento de infeções secundárias. Se não forem utilizadas medidas de controlo apropriadas esta doença pode levar a perdas avultadas durante a época de cultivo. Atualmente, as estratégias de controlo da doença assentam exclusivamente na aplicação preventiva de fitoquímicos durante a época de cultivo, acarretando problemas ambientais graves. O conhecimento profundo dos mecanismos de resistência das plantas resistentes a infeção por Plasmopara vitícola é importante para definir métodos alternativos de controlo. Em estudos anteriores a interação entre a videira e o P. viticola foi caracterizada por uma abordagem de biologia de sistemas. Uma análise detalhada das diferenças entre a resposta de genótipos suscetíveis (interação compatível) e resistentes (interação incompatível) a este patogénio, ao nível da transcritómica, metabolómica e proteómica, permitiu a identificação de mecanismos e de candidatos associados ao estabelecimento da interação incompatível. Um dos candidatos é uma subtilisin-like protein, também denominada subtilase. As subtilases são proteases serínicas que exercem funções altamente específicas no desenvolvimento das plantas e em cascatas de sinalização. Na década passada, vários estudos realçaram o papel das subtilases na resposta de defesa a agentes patogénicos nomeadamente no reconhecimeno dos efetores dos patogénios, sinalização e ativação de uma resposta imunitária da planta. Apesar do mecanismo de acção das subtilases associadas à resposta de defensa contra patogénios não estar ainda elucidado, estudos recentes em plantas modelo como a Arabidopsis e o tomate identificaram a prosistemina (o precursor da sistemina) como o substrato das subtilases durante a ataque por herbívoros e/ou por patógenos. A sistemina é um polipeptídeo com 18 resíduos de aminoácidos ativo presente em concentração muito baixas, que actua na via sinalizadora octadecanóide responsável pela biossíntese do ácido jasmónico (JA). O JA é uma fitohormona vegetal associada a mecanismos de resposta a stress biótico, nomeadamente por patógenios necrotróficos ou herbivoria. Muito recentemente, estudos do nosso grupo de investigação demonstraram o envolvimento do JA na resposta da videira ao patogénio biotrófico Plasmopara viticola. A sistemina, como substrato das subtilases foi inicialmente isolada das folhas de tomate Lycopersicum esculentum Mill., sendo demonstrado que quando uma folha é ferida por herbivoria ou mecanicamente, os genes codificadores de sistemina são expressos, transcritos e rapidamente transportados via floema para outras partes da planta ainda intactas. A sistemina atua sobre cinases proteicas activadas por mitogénio, levando à ativação de fosfolipases e consequente libertação do ácido linoléico das membranas plastidiais. O ácido linoléico é utilizado na síntese do JA que regula, via feedback positivo, a expressão génica da prosistemina. O ácido jasmónico produzido move-se através do sistema vascular onde alcança folhas intactas, desencadeando o processo de defesa. Em estudos anteriores, a família de subtilases de videira foi caracterizada e candidatos putativamente associados à resposta de defesa da videira à infeção com o Plasmopara viticola foram identificados. Com o presente trabalho pretende-se validar o envolvimento desses candidatos na resposta de defesa da videira ao P.viticola, avaliar a sua relação com a elicitação por fitohormonas (JA e ácido salicílico (SA)), e selecionar um candidato para validação funcional. A expressão de 5 genes que codificam as subtilases VviSBT3.19 Isoforma X2, VviSBT5.3a, VviSBT4.19 Isoforma X1, VviSBT3.20, VviSBT3.21 Isoforma X1, previamente identificadas como candidatos associados à resistência da videira ao P. viticola foi avaliada por Reação de Polimerização em cadeia em tempo real (qPCR). A sua expressão foi avaliada em dois genótipos de videira, suscetível e resistente ao P. viticola, após inoculação com o patogénio e elicitação com JA e SA. A expressão das subtilases VviSBT5.3a e VviSBT4.19 é aumentada nas primeiras horas (6h), tanto após inoculação como também após elicitação por JA no genótipo resistente, sugerindo o seu envolvimento na resposta imunitária da videira ligada à sinalização por JA. O gene VviSBT4.19 foi selecionado para uma caracterização molecular e funcional de forma a elucidar a sua estrutura e função na resistência da videira ao P. vitícola. A região codificante do gene VviSBT4.19 foi amplificada usando oligonucleótidos específicos para a mesmo. Posteriormente foi efectuada a clonagem da região codificante desta subtilase num vetor de propagação (pJET1.2/blunt) e subsequentemente no vetor de expressão (pET28a(+)). A clonagem e a expressão foram feitas em bactérias adequadas para cada etapa nomeadamente, E. coli TOP10 para clonagem, E. coli BL21codão+ e Turner para expressão. A produção da proteína recombinante foi feita pela adição de β-D-1-tiogalactopiranosideo isopropílico (IPTG). Na análise por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), não foi possível observar nenhuma banda correspondente à massa molecular da proteína de interesse para a abordagem de indução de expressão aplicada. Para confirmar se o não aparecimento da banda da proteína de interesse no gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sódio era devido a baixa expressão ou ausência da mesma, a expressão da proteína recombinante foi analisada por dot blot, uma técnica análoga a western blot, utilizando anticorpos anti-caudas de histidina, porque a proteína de interesse estava em fusão com resíduos de histidina na região N-terminal. Duas das cinco bactérias Turner induzidas por adição de IPTG foram reconhecidas pelos anticorpos. A determinação da estrutura desta subtilase é fundamental para a compreensão da sua importância e função na resistência da videira ao P. viticola. No momento, estamos a tentar otimizar as condições de expressão e do western blot para ultrapassar os problemas ligados a produção da proteína recombinante e interacção entre a mesma e anticorpos, para poder prosseguir com a purificação da mesma, identificação através da espectrofotometria de massa e posterior estudo da atividade enzimática. Se estes problemas de expressão persistirem vamos seguir uma nova abordagem de expressão que consistirá no uso de vetores eucariotas específicos para expressão e sistemas de expressão eucariotas que foram anteriormente descritas para expressão de subtilases de plantas nomeadamente, células de insetos, usadas na expressão da subtilase de tomate LeSBT1 e sistemas de cultura em suspensão usada na expressão da outra subtilase de tomate denominada LeSBT3. Estes sistemas são mais adequados para a expressão de subtilisinas quando comparados aos vetores ou sistemas de origem procariotas.One of the most important fruit plant cultivated worldwide is grapevine (Vitis vinifera L.), mainly due to its economic importance in the wine industry. In 2016 the world area under vines was 7.5 million hectares representing a production over 75.8 million tones, being the European Union the leading producer of wine (OIV, 2017). The domesticated grapevine is highly susceptible to downy mildew caused by the obligatory oomycete Plasmopara viticola. This pathogen affects the leaves and shoots, being downy mildew disease characterized by the presence of oil spots on the surface of leaves and white down that can be seen on the underside of the leaves, canes and bunches in periods of high humidity. This disease results in great losses in entire vineyards when control measures are not implemented. The current disease control strategies include the massive use of fungicides, which are very prejudicial to human health. A deeper understanding of the resistance mechanisms is crucial to define alternative control methods. Subtilisin-like proteases (subtilases) belong to a large group of serine proteases present among all organisms such as archaea, bacteria, eukarya, fungi and yeast. My research group has previously characterized the grapevine subtilase gene family, highlighting the involvement of some subtilases in P. viticola resistance. The action mechanisms of subtilases involved in plant defense against pathogens are still unknown; however recent studies have identified prosystemin as the subtilase SBT3 substrate and highlighted the role of the processed systemin in the octadecanoid pathway for jasmonic acid (JA) biosynthesis. In the present work, we have selected 5 subtilase genes namely, VviSBT3.19 Isoform X2, VviSBT5.3a, VviSBT4.19 Isoform X1, VviSBT3.20, VviSBT3.21 Isoform X1, and analysed their expression in two Vitis genotypes (resistant and susceptible to downy mildew), after inoculation with P. viticola and elicitation with either JA or salicylic acid (SA). Our results showed that the expression of VviSBT5.3a and VviSBT4.19 increase after both P. viticola inoculation and JA elicitation in resistant grapevine genotype in the first hours after inoculation and elicitation. These results suggest subtilases’ involvement in the grapevine immunity. The grapevine subtilase VviSBT4.19 was selected for further functional characterization aiming to unravel its structure and function The VviSBT4.19 coding sequence was isolated and cloned into both propagation vector (pJET1.2/blunt) and expression vector (pET28a(+)). Two bacteria strains, E. coli BL21codon plus and Turner, were tested for recombinant protein production. VviSBT4.19 expression was tested by induction with IPTG. Although the SDS-PAGE gel did not show a band corresponding to the VviSBT4.19 protein size, a dot blot analysis was performed. Anti-poly-His-tag antibodies were used and a positive result was obtained for IPTG induction. The determination of this subtilase structure will be crucial to understand its importance and function in grapevine resistance against P. viticola

Tratamento ortodôntico e a apneia obstrutiva do sono

A apneia obstrutiva do sono é um distúrbio relacionado a respiração durante o sono que atinge indivíduos de todas as idades. Seu estudo e tratamento são de extrema importância, dada a alta prevalência na população e suas consequências, como a diminuição no desempenho neurocognitivo e no crescimento e sonolência e fadiga diurna excessiva. Entre os tratamentos, destacam-se o avanço ortopédico ou cirúrgico da mandíbula, visando corrigir a retroposição mandibular e a expansão rápida da maxila, que permite um reposicionamento da língua. O avanço estimula o crescimento mandibular de forma passiva ou ativa, avançando a língua e mudando as estruturas faríngeas. A expansão separa a sutura palatina mediana, expandindo a cavidade oral e envolve a colocação do aparelho fixo (Hyrax) dento-suportado por bandas cimentadas ou com cobertura acrílica por oclusal (McNamara). Mais estudos e meta análises são necessários para substanciar ainda mais o tratamento da apneia obstrutiva do sono pela ortodontia.Obstructive sleep apnea is a sleep-related breathing disorder that affects individuals of all ages. Its study and treatment are of extreme importance, given the high prevalence in the population and its consequences, such as the decrease in neurocognitive performance and growth and drowsiness and excessive daytime fatigue. Treatments include the orthopedic or surgical advancement of the mandible, aiming to correct the mandibular retroposition and rapid expansion of the maxilla, which allows a repositioning of the tongue. The advancement stimulates mandibular growth in a passive or active way, advancing the tongue and changing the pharyngeal structures. The expansion separates the medial palatine suture, expanding the oral cavity, and involves the placement of the fixed (Hyrax) dento-supported by cemented bands or occlusal acrylic cover (McNamara). Further studies and meta-analyzes are needed to further substantiate the treatment of obstructive sleep apnea by orthodontics

Caracterização de uma população portuguesa com miocardiopatia hipertrófica seguida num hospital terciário artigo científico

Trabalho final do 6º ano médico com vista à atribuição de grau de mestre no âmbito do ciclo de estudos de mestrado integrado em medicina, apres. à Faculdade de Medicina de CoimbraIntrodução – A miocardiopatia hipertrófica é a doença cardíaca genética mais comum, definida pela presença de hipertrofia miocárdica inexplicada. Possui um espectro clínico muito amplo, podendo os doentes permanecer assintomáticos durante toda a vida ou, pelo contrário, apresentar sintomas severos como síncope, insuficiência cardíaca congestiva e fibrilhação auricular. A morte súbita cardíaca é a complicação mais séria e o diagnóstico pode ser estabelecido pela observação ecocardiográfica de hipertrofia 15 mm em qualquer segmento miocárdico, mais frequentemente no septo interventricular. Objectivos – Caracterização clínica e ecocardiográfica de uma população portuguesa com diagnóstico de miocardiopatia hipertrófica, seguida num hospital terciário. Metodologia – Foram analisados os parâmetros dos ecocardiogramas transtorácicos (modo M, 2D, Doppler) de 74 doentes com miocardiopatia hipertrófica realizados entre 1999 e 2008 no serviço de Cardiologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra. Em 2009 foi realizado um follow-up a 34 (45,9%) desses doentes, tendo sido avaliada a existência de sintomas associados à miocardiopatia hipertrófica, hospitalização devido a problemas cardiovasculares decorrentes da doença, medicação cardiovascular habitual e história familiar sugestiva. Resultados – Os exames analisados demonstraram prevalência de um grau importante de hipertrofia do septo interventricular (espessura média 17,5±4,7 mm) e de dilatação da aurícula esquerda (diâmetro médio 47,4±8,9 mm). Verificou-se também, numa proporção considerável, alterações da válvula mitral: insuficiência (73%) e movimento sistólico anterior (43,2%) que provocava obstrução dinâmica do fluxo de saída do ventrículo esquerdo em 41,9%, suficiente para produzir um gradiente significativo, cujo valor médio apurado foi 55,6±31,9 mmHg. A análise da distribuição segmentar da hipertrofia miocárdica permitiu verificar que o segmento mais frequentemente atingido era o septo interventricular (95,9%) e que em cerca 3 de 40% dos doentes apenas um segmento miocárdico se encontra hipertrofiado, sendo a proporção idêntica à obtida para 3 ou mais segmentos afectados. O follow-up permitiu observar que em 94,1% os doentes apresentavam sintomatologia relacionada com a miocardiopatia hipertrófica, nomeadamente dispneia de esforço (79,4%), palpitações (73,5%), tonturas (52,9%) e precordialgia (38,2%). Em 32,4% dos casos foram reportados antecedentes familiares sugestivos e foi referida história de hospitalização devida a causa cardiovascular em 18 casos (52,9%). Grande parte dos doentes (91,2%) efectuava medicação cardiovascular, estando a maioria medicada com bloqueadores beta-adrenérgicos e/ou bloqueadores dos canais de cálcio. Conclusões – Este estudo revelou que a população analisada apresenta, de forma genérica, características similares às de populações integradas em estudos internacionais, assim como o follow-up demonstrou resultados que encontram suporte em trabalhos publicados.Background – Hypertrophic cardiomyopathy is the most common genetic cardiac disease, defined by the presence of unexplained myocardiac hypertrophy. There is a wide clinical spectrum, ranging from patients who are asymptomatic throughout their lives to severe symptoms such as syncope, congestive heart failure and atrial fibrillation. Sudden cardiac death is the most serious complication and the diagnosis may be established by echocardiographic observation of hypertrophy 15 mm in any myocardial segment, mostly the interventricular septum. Objective – Clinical and echocardiographic characterization of a Portuguese population diagnosed with hypertrophic cardiomyopathy, attended in a tertiary center. Methods – We analyzed the echocardiographic exams (M-mode, 2D, Doppler) of 74 patients with hypertrophic cardiomyopathy performed between 1999 and 2008 at the Department of Cardiology of the Coimbra University Hospital. In 2009, 34 (45.9%) patients were followedup and it was assessed the existence of hypertrophic cardiomyopathy associated symptoms, cardiovascular-related hospitalization, usual cardiovascular medication and suggestive familiar history. Results – The analyzed exams demonstrated an important degree of interventricular septum hypertrophy (average thickness 17.5±4.7 mm) and left atrial enlargement (average diameter 47.4±8.9 mm). Mitral valve abnormalities were observed in a considerable proportion of patients: insufficiency (73%) and systolic anterior motion (43.2%) which leaded to dynamic left ventricular outflow obstruction (41.9%), sufficient to produce a significant gradient (average registered value 55.6±31.9 mmHg). The myocardial hypertrophy segmental distribution analysis showed that the most frequently affected segment was the interventricular septum (95.9%), about 40% of the patients had only one hypertrophied segment and an identical percentage had 3 or more affected segments. The clinical follow-up revealed that 94.1% of the patients presented hypertrophic cardiomyopahty associated symptomatology, namely exertion dyspnea (79.4%), palpitations (73.5%), dizziness (52.9%) and chest pain (38.2%). In 32.4% of the cases suggestive family history was reported and 18 (52.9%) cases registered prior cardiovascular-related hospitalization. A very significant percentage of patients (91.2%) were under cardiovascular medication, mostly with beta-adrenergic blockers and/or calcium channel blockers. Conclusions – This study revealed that the analyzed population has, generically, similar characteristics of those studied in international investigations, as well as the follow-up data are supported by many published papers

Project of a bandgap voltage reference and a temperature sensor for "energy harvest" systems

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Electrotécnica e ComputadoresThe objective of this thesis is to study the behaviour of a bandgap voltage reference and develop it in order to be more efficient than the existing ones. In this case having applicability in energy harvest, the main approach for this circuit is to reduce the power dissipation and at the same time guarantee a stable of the reference voltage. This can be achieved through the utilization of MOS transistors which can work with a lower voltage then bipolar transistors. The reference voltage circuit present in this thesis can work with a supply voltage as low as 500 mV. In energy harvest systems besides the need to work with extremely low voltages, the sensitivity of the signals is very high, to temperature variation. So it was also important to work with an extended ranges of temperature. For this work it was also developed a temperature sensor so that it has applicability in various fields. The sensor works by currents generated by the bandgap voltage reference, having similar results to a dual slope integrating analogue-to-digital converter, although its operation and logic are quite different. The proposed solution is to implement a reference voltage generator powered by a voltage source of 500 mV, with a consumption of about 7 W. Having a temperature coefficient slightly below 74 ppm/ C and a temperature sensor with linearity quite satisfactory

Contracts Between Small Scale Soybean Farmers and the Biodiesel Industry in Brazil: An Application of Principal-Agent Model

A contract is considered incomplete when the optimal solution for a contractual problem requires some information from the parts which is not observable by one or both parts. This problem is found in the biodiesel production chain among small scale farmers and biodiesel companies in Brazil, which is regulated by a certification called Social Fuel Seal under the framework of the PNPB (Brazilian Program for Production and Use of Biodiesel). In order to minimize this hindrance, an incentive structure was elaborated utilizing the nonlinear programming. The Principal-Agent approach was used to verify if these new incentives allow for the small scale soybean farmer to put great effort level in the agricultural production. When the incentive structure is evaluated through the model proposed, the result indicates that both the farmer and the biodiesel company will have their profits maximized if the producer puts on great effort. Thus, it is clear the importance to include this mechanism of stimulation to productivity increase into the PNPB framework in order to contribute to the competitiveness of the Biodiesel chain in Brazil

Contributos do turismo para a qualidade de vida

Mestrado em Gestão e Planeamento em TurismoA promoção da qualidade de vida é uma das principais aspirações da Humanidade. Definida como o resultado da soma das condições económicas, sociais, ambientais e culturais de que um indivíduo pode beneficiar e da percepção que tem da satisfação com a sua vida, este conceito foi ganhando espaço junto de diversas instituições políticas, tendo sido assumida, pela ONU, como o grande objectivo a alcançar no século XXI. A relação entre qualidade de vida e turismo sustentável é evidente na medida em que um dos objectivos inerentes à sustentabilidade do turismo consiste na garantia da qualidade de vida dos residentes no destino turístico. Partindo do pressuposto da existência dessa relação, esta investigação surge na perspectiva que o turismo pode representar uma mais-valia para a qualidade de vida da população de um destino turístico. A revisão de literatura e a análise de diversos sistemas de indicadores utilizados para avaliar a qualidade de vida, o desenvolvimento sustentável e o turismo sustentável permitiu a definição de uma proposta inicial de indicadores habilitados a avaliar o contributo do turismo para a qualidade de vida no destino turístico. O estudo empírico, aplicado na Área Metropolitana do Porto, teve por base a técnica de Delphi na qual participaram um conjunto de responsáveis por instituições/empresas que operam nas áreas de negócios definidas pela Conta Satélite do Turismo como produtos característicos da oferta turística com o objectivo de validar essa proposta e definir o sistema de indicadores que permita avaliar o contributo do turismo para qualidade de vida no destino turístico. O sistema de indicadores proposto é composto por 26 indicadores divididos por cinco dimensões: ambiental, económica, social, cultural e política.The promotion of quality of life is one of the main aspirations of mankind. Defined as the result of the sum of economic, social, environmental and cultural that an individual can benefit and a perception that satisfaction with his life, this concept has been gaining ground from several political institutions and has been taken by the United Nations as the major objective to achieve in the twenty-first century. The relationship between quality of life and sustainable tourism is evident in that way one of the objectives of the sustainability of tourism is the guarantee of the quality of life for residents of a tourist destination. Assuming the existence of this relationship, this research appears in the view that tourism can represent an added value to the quality of life on a tourist destination. The literature review and the analysis of several indicators systems used to assess the quality of life, sustainable development and sustainable tourism has allowed the definition of an initial proposal of indicators able to assess the contribution of tourism to the quality of life in a tourist destination. The empirical study applied to the Metropolitan Area of Porto, was based on the Delphi technique attended by a number of responsible institutions / companies operating in the business areas defined by the Tourism Satellite Account as characteristic products of tourism with the aim to validate the proposal and establish the system of indicators for assessing the contribution of tourism to the quality of life at tourist destination. The indicator system proposed consists in 26 indicators divided among five dimensions: environmental, economic, social, cultural and political

GÊNERO E SAÚDE MENTAL: Um Olhar sobre as Mulheres Negras Professoras Universitárias

O presente artigo versa sobre gênero e saúde mental, a partir do olhar sobre professoras negras universitárias. Os estudos sobre as relações raciais são relevantes aos profissionais que atuam nas políticas sociais públicas no Brasil, haja vista, a formação social e histórica do país produzir desigualdades baseadas na raça e no gênero. Assim contribuir para a visibilidade sobre a desigualdade racial que atinge mulheres negras no espaço universitário se torna o objetivo do estudo, por entender que elas são o alvo preferencial de práticas racistas. Para tanto, pesquisa bibliográfica sobre gênero, saúde mental e raça se tornam essenciais. Nessa perspectiva, dividimos o artigo em dois tópicos: o primeiro trata do debate de gênero e raça e coloca em evidencia a mulher negra; o segundo dialoga sobre trabalho docente e saúde mental, buscando realizar as primeiras aproximações com a realidade vivenciada por mulheres negras professoras universitárias.Palavras-Chave: gênero; raça; desigualdade; universidade

Implementação de um sistema de Business Intelligence para o suporte à tomada de decisão de um setor de produção

TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro Tecnológico. Engenharia de Controle e Automação.O avanço tecnológico crescente relacionado a hardware e software, permite que as organizações empresariais realizem a captação automatizada, armazenamento e transformação dos dados produzidos por seus processos, e posteriormente, a transformação destes dados em informação. Este processo valoriza os dados ao contextualizar e gerar conhecimento por meio de análises e tomadas de decisão mais assertivas. A fim de se manterem competitivas frente a estas mudanças, as empresas apresentam a necessidade de desenvolver sistemas que forneçam informações baseadas em dados de maneira eficiente. Neste cenário, este documento apresenta a fundamentação teórica acerca de tecnologias de sistemas de apoio à tomada de decisão, assim como as metodologias de desenvolvimento e ferramentas que envolvem a implementação de uma solução de Business Intelligence, que tem por objetivo apresentar indicadores táticos e operacionais que dão suporte aos processos de planejamento, programação e controle de um setor de produção. O sistema desenvolvido fornece informações inferidas por dados coletados dos processos produtivos realizados pelo setor de produção de forma eficiente, permitindo o monitoramento das atividades e a rápida tomada de decisão dos gestores da área