Neue Einblicke zum Apoptose-antagonisierenden Transkriptionsfaktor (AATF) im Zentrum der ribosomalen Biogenese: Eine umfassende proteomische Analyse

Der humane Organismus besteht aus unzähligen, stetig proliferierenden Zellen. Fehler in diesem wichtigen Prozess können schwerwiegende Erkrankungen verursachen. Um dies zu vermeiden ist die Zelle mit zahlreichen Kompensationsmechanismen ausgestattet - unweigerlich wird dabei eine Stressreaktion ausgelöst. Genotoxischer Stress beschreibt dabei jegliche Ereignisse, die zu einer Veränderung der Zusammensetzung und Organisation des genetischen Materials führen kann. Die DNA Damage Response (DDR) ist ein komplexes Netzwerk aus Signalkaskaden, deren Ablauf durch unterschiedlichste Faktoren beeinflusst wird. Am Ende steht eine schicksalshafte Entscheidung: Wird der Zellzyklus angehalten, um die Schäden zu reparieren oder sind diese so ausgeprägt, dass die Apoptose eingeleitet werden muss, um die genomische Integrität zu wahren? In dieser Arbeit wird der Apoptosis Antagonizing Transcription Factor (AATF) untersucht, welcher in dualistischer Manier als Dirigent zwischen Proliferation, Apoptose und Überleben fungiert. Einige hochrelevante Arbeiten, die in den letzten Jahren zum Verständnis der vielfältigen Rollen von AATF beigetragen haben, stammen aus dem nephrologischen Forschungslabor der Uniklinik Köln unter der Leitung von Prof. Dr. Bernhard Schermer. Darunter ist die Arbeit von Höpker et al. zu nennen, die bereits 2012 genau aufdecken konnte, wie AATF ähnlich einem phosphorylierungsabhängigen molekularen Schalter agiert und über die Tumorprotein 53 (p53) vermittelte Antwort im Rahmen der DDR entscheidet.1 Es folgten zahlreiche weitere Projekte, die mehr und mehr Puzzleteile zum Verständnis unseres heutigen Bildes von AATF lieferten – dazu gehören auch die Interaktionspartner des Proteins. Unmittelbar vor meinem Promotionspraktikum konnte Frau Dr. Heide Heinen, ebenfalls unter Supervision von Frau PD Dr. Katja Höpker, ein umfassendes Interaktom von AATF erstellen. Im Rahmen proteomischer Analysen werden die Proteinnetzwerke einer Zelle oder gar eines ganzen Organismus untersucht. Besonders spannend ist hier, sich diese unter verschiedenen Konditionen anzuschauen, denn durch unzählige Mechanismen können Anpassungen, etwa in Form von veränderter Transkription, Translation oder posttranslationalen Modifikationen vorgenommen werden. Das Proteom ist somit ein höchst dynamisches Gebilde. Mithilfe der Proteomik und insbesondere der Technik der Massenspektroskopie stehen heute automatisierte Techniken zur Verfügung, um Proteine in großer Zahl zu identifizieren und quantifizieren. Frau Dr. Heinen führte eine Analyse der Bindungspartner von AATF vor und nach einer Behandlung mit ultraviolettem (UV) Licht als Beispiel einer DNA-Schädigung durch. Im direkten 9 Vergleich zeigte sich, dass ein Großteil der Interaktionspartner in beiden Konditionen vorkommen. Hingegen konnten 74 Proteine nur nach UV-Behandlung signifikant angereichert werden. Hierunter befanden sich besonders viele ribosomale Proteine. Dreißig Interaktoren, darunter viele Zytoskelett-assoziierte Proteine, konnten nur im Interaktom ohne UV-Behandlung nachgewiesen werden. Meine Experimente planten wir im Folgenden zur Validierung dieser Ergebnisse und Untersuchung einer alternativen zellulären Stressbedingung – der Hypoxie. Während die Validierung der unstimulierten Interaktoren unter einem leicht modifizierten Protokoll nicht vollständig gelang, konnte ich einen Großteil der Interaktionspartner durch bereits publizierte Arbeiten bestätigen und neue Interaktionen identifizieren. Funktionelle Analysen der Bindungspartner, die sich zwischen den beiden Konditionen am stärksten unterscheiden, offenbarten interessante neue Aspekte der zellulären Stressantwort. AATF konnte zudem als Protein im Fokus der ribosomalen Biogenese identifiziert werden. Nahezu 80 % der Interaktionspartner waren RNA-bindende Proteine. Daher planten wir weitere Versuche, die zeigen sollten, ob AATF mit seinen ribosomalen Interaktionspartnern direkt oder über RNA-bindende Proteine agiert. Diese Fragestellung konnten wir mittels eines der Immunopräzipitation vorgeschalteten RNAse Verdaus adressieren und sahen, dass die Mehrheit der Interaktoren nicht RNA-abhängig sind und somit direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen darstellen. Nur zwei Interaktoren waren vollständig RNA-abhängig. Die vorliegende Arbeit bietet damit neue Einblicke in die vielfältigen Funktionen des Proteins

A protein-RNA interaction atlas of the ribosome biogenesis factor AATF

AATF is a central regulator of the cellular outcome upon p53 activation, a finding that has primarily been attributed to its function as a transcription factor. Recent data showed that AATF is essential for ribosome biogenesis and plays a role in rRNA maturation. AATF has been implicated to fulfil this role through direct interaction with rRNA and was identified in several RNA-interactome capture experiments. Here, we provide a first comprehensive analysis of the RNA bound by AATF using CLIP-sequencing. Interestingly, this approach shows predominant binding of the 45S pre-ribosomal RNA precursor molecules. Furthermore, AATF binds to mRNAs encoding for ribosome biogenesis factors as well as snoRNAs. These findings are complemented by an in-depth analysis of the protein interactome of AATF containing a large set of proteins known to play a role in rRNA maturation with an emphasis on the protein-RNA-complexes known to be required for the generation of the small ribosomal subunit (SSU). In line with this finding, the binding sites of AATF within the 45S rRNA precursor localize in close proximity to the SSU cleavage sites. Consequently, our multilayer analysis of the protein-RNA interactome of AATF reveals this protein to be an important hub for protein and RNA interactions involved in ribosome biogenesis