METHYLOMIC SIGNATURE AND MOLECULAR MODELLING TO BETTER UNDERSTAND AUTOPHAGY INDUCED BY PHYTOCHEMICAL IN CACO-2 CELLS

The binomial “autophagy-cancer” is intricate and methylomic studies can help to understand it by changing point of view from a gene level to an -omic one. Recently, autophagy-modulating properties of several phytochemicals have attracted attention in anticancer research. We evaluated whether Indicaxanthin (IND), the peculiar known beneficial phytochemical of prickly pear, seasonally available in the southern Italy, could induce autophagy in Caco2 cells, and whether it results from an epigenomic modification and/or a direct molecular interaction. IND increased autophagy in Caco-2 cells; the methylomic signature, obtained by Reduced Representation Bisulfite Sequencing (15 million of clusters) reported that 14 main genes of autophagy, showed a different methylation consistent with the induction of this phenomenon. Among these: MTOR, ATG13, BECN1, TFEB, ATG3, WIPI2, TECPR1, SNAP29, VPS11, VPS16. By traditional approaches we confirmed the demethylation of BECN1 gene and the increase of Beclin1 levels. By in-silico molecular modelling, we displayed a possible interference of IND, by competitive mechanisms, in the Beclin1-Bcl2 interaction. Methylomic signature and molecular modelling has been helpful to understand autophagy IND-induced in intestinal epithelial tumour cells. Our results suggest that the pro-autophagic action promoted by this phytochemical involves both epigenomic modulation and post-translation mechanisms by direct interaction with key targets of autophagy pathway

Protective effects of melatonin in inflamed intestinal epithelium are associated with reduced NF-κB activation and changes in DNA methylation status

Melatonin is the main product of the pineal gland but is also released in the gastrointestinal tract (GIT). Production of melatonin at GIT is independent of the photoperiod and contributes almost completely to plasma melatonin concentration during daylight hours. The physiological role of melatonin at GIT is poorly characterized but recently anti-inflammatory effects have been reported. In this study, we evaluated the effect of Melatonin in intestinal epithelial cells (IEC) stimulated by Interleukin-1β. Our results clearly show that melatonin at micromolar concentrations inhibits the inflammatory response in IEC. The protective effect is expressed through a marked decrease in release and expression of inflammatory mediators, inhibition of DNA damage, and reduced activation of the NF-κB. Moreover, our results provide evidence that local inhibitor effect of Melatonin can involve an epigenetic mechanism also. In conclusion, our findings suggest that the intake of small amounts of melatonin, comparable with those found in pharmaceutical preparations used for sleep disorders, can also exert beneficial effects to the gastrointestinal physiology

Cytotoxic activity of the histone deacetylase 3-Selective inhibitor Pojamide on MDA-MB-231 triple-negative breast cancer cells

We examined the effects of the ferrocene-based histone deacetylase-3 inhibitor Pojamide (N1-(2-aminophenyl)-N8-ferrocenyloctanediamide) and its two derivatives N1-(2-aminophenyl)-N6-ferrocenyladipamide and N1-(2-aminophenyl)-N8-ferroceniumoctanediamide tetrafluoroborate on triple-negative MDA-MB-231 breast cancer cells. Viability/growth assays indicated that only the first two compounds at 70 μM concentration caused an approximate halving of cell number after 24 h of exposure, whereas the tetrafluoroborate derivative exerted no effect on cell survival nor proliferation. Flow cytometric and protein blot analyses were performed on cells exposed to both Pojamide and the ferrocenyladipamide derivative to evaluate cell cycle distribution, apoptosis/autophagy modulation, and mitochondrial metabolic state in order to assess the cellular basis of the cytotoxic effect. The data obtained show that the cytotoxic effect of the two deacetylase inhibitors may be ascribed to the onset of non-apoptotic cell death conceivably linked to a down-regulation of autophagic processes and an impairment of mitochondrial function with an increase in intracellular reactive oxygen species. Our work expands the list of autophagy-regulating drugs and also provides a further example of the role played by the inhibition of autophagy in breast cancer cell death. Moreover, the compounds studied may represent attractive and promising targets for subsequent molecular modeling for anti-neoplastic agents in malignant breast cancer

Molecular signatures associated with the treatment of triple-negative MDA-MB231 breast cancer cells with the histone deacetylase inhibitors JAHA and SAHA

Jay Amin Hydroxamic Acid (JAHA; N8-ferrocenylN1-hydroxy-octanediamide) is a ferrocene-containing analogue of the histone deacetylase inhibitor (HDACi) suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA). JAHA’s cytotoxic activity on MDA-MB231 triple negative breast cancer (TNBC) cells at 72 h has been previously demonstrated with an IC50 of 8.45 M. JAHA’s lethal effect was found linked to perturbations of cell cycle, mitochondrial activity, signal transduction and autophagy mechanisms. In order to glean novel insights on how MDA-MB231 breast cancer cells respond to the cytotoxic effect induced by JAHA, and to compare the biological effect with the related compound SAHA, we have employed a combination of differential display-PCR, proteome analysis and COMET assay techniques and shown some differences in the molecular signature profiles induced by exposure to either HDACis. In particular, in contrast to the more numerous and diversified changes induced by SAHA, JAHA has shown a more selective impact on expression of molecular signatures involved in anti-oxidant activity and DNA repair. Besides expanding the biological knowledge of the effect exerted by the modifications in compound structures on cell phenotype, the molecular elements put in evidence in our study may provide promising targets for therapeutic interventions on TNBCs

Integrated production of biopolymers with industrial wastewater treatment: Effects of OLR on process yields, biopolymers characteristics and mixed microbial community enrichment

The production of polyhydroxyalkanoates (PHA) using industrial wastewaters as feedstocks is a current and challenging topic. This study investigated the production of biopolymers by a mixed microbial culture under different OLRs equal to 1 kgCOD m-3d-1 (Period 1), 2 kgCOD m-3d-1 (Period 2) and 3 kgCOD m-3d-1 (Period 3). The maximum PHA content was achieved in Period 2 (0.38 gPHA gTSS-1), whereas lower values were obtained in Period 1 (0.13 gPHA gTSS-1) and Period 3 (0.26 gPHA gTSS-1). Overall, the maximum PHA productivity resulted equal to 0.08 gPHA L-1h-1 (P2), 0.05 gPHA L-1h-1 (P1) and 0.04 gPHA L-1h-1 (P3), respectively. The molecular weight of the PHA increased from Period 1 (250 kDa) to Period 2 (417 KDa) and Period 3 (463 KDa), although resulting in a slight decrease of crystallinity degree. Microbial community analysis, revealed a reduction in bacterial diversity and a progressive shift of the microbial community with the increasing OLR. Alpha-diversity indexes based on Operational Taxonomic Units (OTUs) at 99% identity revealed higher species richness (Taxa (S) 280) and diversity (Shannon (H) 4,06) in Period 1, whereas Period 3 was characterized by reduced richness and diversity and higher dominance (Taxa (S) 133, Shannon (H) 2,40). Based on the results obtained, it was pointed out that the OLR variation determined significant effects on the process performances, as well as on the productivity and quality of the biopolymers. This means that OLR is a key control parameter to maximize the PHA production and control the physical-chemical characteristics of the polymers

Indicaxanthin Induces Autophagy in Intestinal Epithelial Cancer Cells by Epigenetic Mechanisms Involving DNA Methylation

Autophagy is an evolutionarily conserved process critical in maintaining cellular homeostasis. Recently, the anticancer potential of autophagy inducers, including phytochemicals, was suggested. Indicaxanthin is a betalain pigment found in prickly pear fruit with antiproliferative and pro-apoptotic activities in colorectal cancer cells associated with epigenetic changes in selected methylation-silenced oncosuppressor genes. Here, we demonstrate that indicaxanthin induces the up-regulation of the autophagic markers LC3-II and Beclin1, and increases autophagolysosome production in Caco-2 cells. Methylomic studies showed that the indicaxanthin-induced pro-autophagic activity was associated with epigenetic changes. In addition to acting as a hypermethylating agent at the genomic level, indicaxanthin also induced significant differential methylation in 39 out of 47 autophagy-related genes, particularly those involved in the late stages of autophagy. Furthermore, in silico molecular modelling studies suggested a direct interaction of indicaxanthin with Bcl-2, which, in turn, influenced the function of Beclin1, a key autophagy regulator. External effectors, including food components, may modulate the epigenetic signature of cancer cells. This study demonstrates, for the first time, the pro-autophagic potential of indicaxanthin in human colorectal cancer cells associated with epigenetic changes and contributes to outlining its potential healthy effect in the pathophysiology of the gastrointestinal tract

An In Vitro Model of Glioma Development

Gliomas are the prevalent forms of brain cancer and derive from glial cells. Among them, astrocytomas are the most frequent. Astrocytes are fundamental for most brain functions, as they contribute to neuronal metabolism and neurotransmission. When they acquire cancer properties, their functions are altered, and, in addition, they start invading the brain parenchyma. Thus, a better knowledge of transformed astrocyte molecular properties is essential. With this aim, we previously developed rat astrocyte clones with increasing cancer properties. In this study, we used proteomic analysis to compare the most transformed clone (A-FC6) with normal primary astrocytes. We found that 154 proteins are downregulated and 101 upregulated in the clone. Moreover, 46 proteins are only expressed in the clone and 82 only in the normal cells. Notably, only 11 upregulated/unique proteins are encoded in the duplicated q arm of isochromosome 8 (i(8q)), which cytogenetically characterizes the clone. Since both normal and transformed brain cells release extracellular vesicles (EVs), which might induce epigenetic modifications in the neighboring cells, we also compared EVs released from transformed and normal astrocytes. Interestingly, we found that the clone releases EVs containing proteins, such as matrix metalloproteinase 3 (MMP3), that can modify the extracellular matrix, thus allowing invasion

Genotoxicity and epigenotoxicity of carbazole-derived molecules on mcf-7 breast cancer cells

The carbazole compounds PK9320 (1-(9-ethyl-7-(furan-2-yl)-9H-carbazol-3-yl)-N-methylmethanamine) and PK9323 (1-(9-ethyl-7-(thiazol-4-yl)-9H-carbazol-3-yl)-N-methylmethanamine), second-generation analogues of PK083 (1-(9-ethyl-9H-carbazol-3-yl)-N-methylmethanamine), restore p53 signaling in Y220C p53-mutated cancer cells by binding to a mutation-induced surface crevice and acting as molecular chaperones. In the present paper, these three molecules have been tested for mutant p53-independent genotoxic and epigenomic effects on wild-type p53 MCF-7 breast adenocarcinoma cells, employing a combination of Western blot for phospho-γH2AX histone, Comet assay and methylation-sensitive arbitrarily primed PCR to analyze their intrinsic DNA damageinducing and DNA methylation-changing abilities. We demonstrate that small modifications in the substitution patterns of carbazoles can have profound effects on their intrinsic genotoxic and epigenetic properties, with PK9320 and PK9323 being eligible candidates as “anticancer compounds” and “anticancer epi-compounds” and PK083 a “damage-corrective” compound on human breast adenocarcinoma cells. Such different properties may be exploited for their use as anticancer agents and chemical probes

ENHANCED BIOREMEDIATION E MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO DI ACQUA CONTAMINATA DA SOLVENTI CLORURATI

I solventi clorurati sono composti organici di sintesi appartenenti alla classe degli idrocarburi alifatici clorurati, largamente impiegati in diversi settori industriali e, come conseguenza, ampiamente diffusi nell’ambiente come inquinanti e particolarmente pericolosi anche per la salute umana. Tra i metodi di bonifica di siti contaminati da solventi clorurati, quelli basati sul biorisanamento sfruttano uno dei peculiari metabolismi batterici coinvolti nella biodegradazione di tali composti: la declorurazione riduttiva anaerobia in cui il composto clorurato è utilizzato come accettore terminale di elettroni in un vero e proprio processo di respirazione anaerobia, detta dealorespirazione; il cometabolismo aerobio in cui il composto clorurato viene fortuitamente ossidato ad opera di ossigenasi batteriche normalmente utilizzate per l’uptake del substrato di crescita preferenziale; l’ossidazione aerobia diretta in cui il composto clorurato funge da donatore di elettroni e substrato di crescita primario per il microrganismo. Il presente lavoro di tesi di dottorato si è occupato della caratterizzazione microbiologica di un’acqua contaminata da solventi clorurati, prevalentemente da 1,2-dicloroetano (1,2-DCA), e della valutazione del suo potenziale di biodegradazione, con l’obiettivo di sfruttare consorzi microbici autoctoni alla matrice contaminata per la definizione di un eventuale intervento di biorisanamento in situ. Le comunità microbiche autoctone dell’acqua contaminata sono state dapprima caratterizzate in termini di struttura, diversità e composizione, mediante ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) e 16S rRNA metabarcoding, evidenziando una grande variabilità: campioni di acqua raccolti da diversi punti di prelievo e in diversi periodi sono risultati infatti piuttosto eterogenei, sia da un punto di vista chimico-fisico che da un punto di vista microbiologico. Abbastanza limitata è risultata la presenza di specie batteriche note in grado di degradare solventi clorurati. La biodegradazione di 1,2-DCA è stata successivamente valutata mediante analisi gascromatografiche in spazio di testa effettuate in microcosmo. Allo scopo di indagare tutti i metabolismi biodegradativi noti nei confronti di 1,2-DCA, sono stati allestiti e opportunamente biostimolati microcosmi in aerobiosi e anaerobiosi. I microcosmi sono stati realizzati all’interno di vials con acqua contaminata, un opportuno terreno di coltura e una quota aggiunta di 1,2-DCA. Il monitoraggio della concentrazione di 1,2-DCA nel tempo ha mostrato elevati abbattimenti nei microcosmi anaerobi biostimolati in presenza/assenza di lattato e nei microcosmi biostimolati in presenza di O2. In entrambi, la caratterizzazione della comunità microbica ha evidenziato la presenza di batteri in grado di svolgere declorurazione riduttiva di solventi clorurati e dealogenazione idrolitica di 1,2-DCA. Nel DNA metagenomico dei suddetti microcosmi è stata anche rilevata la presenza di sequenze dei geni per una dealogenasi riduttiva specifica per 1,2-DCA (dcaA) e per la aloalcano dealogenasi (dhlA). Un’efficiente biodegradazione di 1,2-DCA è stata evidenziata anche in una simulazione di sistema di Barriera Reattiva Permeabile in colonna biostimolato con poli-β-idrossibutirrato (PHB), quale substrato fermentabile e donatore di elettroni a lento rilascio per i processi di declorurazione riduttiva. Il sistema in colonna è stato alimentato con l’acqua contaminata, inoculata con un consorzio batterico precedentemente arricchito su PHB. Infine, è stata avviata una sperimentazione che vede l’utilizzo di carrier biopolimerici biodegradabili come innovativa tecnologia di immobilizzazione di batteri biodegradatori direttamente reclutati dall’acqua contaminata, allo scopo di ottenere una maggiore efficienza di biodegradazione di solventi clorurati, a basso costo e in maniera ecocompatibile. Supporti in acido polilattico hanno dato preliminari evidenze sia di assorbimento del contaminante 1,2-DCA, sia di adesione microbica quando immersi nell’acqua contaminata in un sistema a scala di microcosmo

Due diverse esperienze di lezioni sperimentali condotte secondo il metodo di co-teaching

Nell’ambito del progetto “Mentori per la didattica”, nato nel 2013 da un ristretto gruppo di docenti dell’Università di Palermo e che comprende oggi 120 docenti, oltre alle attività di mentoring fra pari, sono state promosse diverse attività formative. Fra queste, tre workshop in tre anni consecutivi sono stati dedicati alla formazione sull’active learning e su metodi e tecniche di didattica innovativa ed in particolare nell’ultimo anno è stata importante la partecipazione di alcuni componenti del progetto al congresso “Faculty development“ e al pre-workshop del convegno di Genova di maggio 2019. A partire da tutte queste esperienze, diversi docenti hanno iniziato a sperimentare nuove modalità didattiche, soprattutto per raggiungere efficacemente un’acquisizione stabile dei contenuti attraverso una partecipazione attiva dello studente o anche attraverso una innovativa forma di insegnamento, particolarmente incisiva dal punto di vista comunicazionale. Le esperienze che qui si riportano sono state applicate in via sperimentale a un’unica lezione di “Genetica umana” nel corso di laurea magistrale in Biologia Molecolare e della Salute (Classe LM6) e a un’unica lezione di “Fisiologia generale” nel corso di laurea a ciclo unico in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche, entrambi corsi tenuti presso l’Università di Palermo. Le due esperienze sono state progettate e portate avanti secondo modalità differenti, di conseguenza è stato possibile ottenere, a conclusione, due risultati diversi ma comparabili. In particolare, la lezione di Genetica umana è stata condotta con due docenti in aula, esperti della stessa disciplina, che hanno scelto di alternare i propri interventi all’interno di uno stesso micro argomento con il risultato che un unico concetto è stato presentato dalla voce alternata dei due docenti con l’aiuto di tecniche sia di activelearning che di team-based learning. L’alternanza delle voci, entrambe esplicative di una stessa diapositiva o di uno stesso concetto, è stato scelto come stile principale della lezione (denominato “stile orizzontale”). A conclusione, il riepilogo dei concetti principali con l’assegnazione dei concetti "homeworks” è stato condotto da entrambi i docenti presenti in aula, ciascuno per alcuni specifici argomenti. La lezione di Fisiologia generale si è tenuta con uno stile di co-teaching diverso dal precedente che è stato denominato “verticale”. In aula è stata prevista la presenza di due docenti di due materie diverse: il docente titolare, quello di Fisiologia della nutrizione, ed anche il docente di “Patologia (con Terminologia medica)”. È importante evidenziare che Fisiologia generale e Patologia (con Terminologia medica) rappresentano i due moduli dello stesso corso integrato. L’efficacia di questo specifico co-teaching è stata incentrata sulla trasversalità di alcuni concetti affrontati sia in condizioni fisiologiche (a cura del primo docente) che patologiche (a cura del secondo docente). È stato dato ampio spazio alle numerose curiosità interdisciplinari da parte degli studenti presenti in aula ed i loro interventi hanno fornito un primo indice di positività formativa di questa sperimentazione didattica. In questo modo, l’argomento (nel caso specifico “il Diabete”), è stato porto agli studenti nella sua interezza, alternando gli aspetti Fisiologici con quelli Patologici. Secondo le modalità e le procedure decise all’interno del progetto “Mentori per la didattica” per queste lezioni sperimentali è stato, dai proponenti, richiesta l’attività di “mentoring on demand” secondo la quale due docenti esterni al corso ed appartenenti ad aree CUN diverse hanno assistito, separatamente, ad ognuna delle due lezioni come osservatori (o meglio come “mentori”) per offrire un parere esterno valido sul punto di vista dell’efficacia formativa e della qualità della didattica. Sia gli studenti, intervistati con un questionario, che i docenti coinvolti in questa esperienza di didattica sperimentale, hanno ritenuto soddisfacente l’esperienza