Caracterización de los mecanismos y factores clave en la nucleación primaria de α-sinucleína asociada a la agregación amiloide en la enfermedad de Parkinson

α-sinucleína (αS) es una proteína neuronal presináptica intrínsecamente desordenada cuyo mal plegamiento y agregación en forma de fibras amiloides es el sello distintivo de diferentes trastornos neurodegenerativos conocidos como sinucleinopatías. Entre estos trastornos cabe destacar especialmente la enfermedad de Parkinson, asociada típicamente al envejecimiento y que constituye la segunda enfermedad neurodegenerativa más común en el mundo.Crecientes evidencias experimentales sugieren que αS puede generar diferentes tipos de polimorfos amiloides con diferentes toxicidades y grados de infectividad, lo que sugiere un vínculo potencial entre la estructura y la patología de estas especies. Comparaciones estructurales entre polimorfos han sugerido recientemente que los polimorfos de αS que se han generado in vitro hasta ahora difieren notablemente de los que se obtienen a partir de extractos de cerebro de pacientes, lo que sugiere que las condiciones utilizadas hasta la fecha para inducir agregación de la proteína in vitro no recapitulan los mecanismos y rutas amiloides que tienen lugar in vivo, siendo éstos aún desconocidos. En este sentido sólo se han explorado hasta la fecha condiciones de agregación de αS in vitro en las que el proceso se inicia mediante nucleación heterogénea a través de interfases hidrofóbicas/hidrofílicas, quedando por esclarecer si αS es capaz de autoensamblarse a través de una nucleación homogénea.En esta tesis se ha logrado ampliar nuestro conocimiento sobre los mecanismos moleculares y los factores, tanto intrínsecos como extrínsecos, que desencadenan el autoensamblaje de αS, así como caracterizar diferentes rutas de agregación amiloide de esta proteína y los polimorfos generados a través de las mismas. Hemos podido descubrir que el grado de hidratación de la proteína es un factor decisivo para el control de la velocidad de nucleación, siendo excesivamente lenta en condiciones de alta hidratación o acelerándose en varios órdenes de magnitud al reducirse la actividad de agua. Además, el grado de hidratación también dictamina la preferencia por el tipo de nucleación primaria, siendo la nucleación homogénea el proceso más favorable en condiciones de hidratación limitadas, como las que tendrían lugar en el interior de condensados biomoleculares generados por separación de fases líquido-líquido. Dependiendo del tipo de nucleación más favorable según las condiciones en las que se encuentra αS, se formarán polimorfos estructurales amiloides drásticamente diferentes, que difieren en todos los niveles posibles de variabilidad estructural, desde su contenido estructural secundario y orientación peptídica hasta la organización cuaternaria de los protofilamentos constituyentes. Por otro lado, hemos identificado el papel que juegan las diferentes regiones de αS en el mecanismo de nucleación primaria heterogénea, hallando la existencia de dos regiones clave, un en torno a los residuos 1-20 y que se encuentra involucrada en la interacción de la proteína con las interfases y otra en torno a los residuos 70-90 que se haya involucrada en el establecimiento de los puentes de hidrógeno intermoleculares que darán lugar a la formación del núcleo amiloide. Así mismo, hemos logrado comprender la importancia, para la nucleación primaria heterogénea, de la configuración de la cadena peptídica, y concretamente de la región NAC, al adsorberse a superficies hidrofóbicas y el papel que juega la región C-terminal en modularla.Estos hallazgos contribuyen en gran medida a comprender el complejo paisaje conformacional de la agregación amiloide de αS y abren la puerta al estudio de nuevas rutas de agregación amiloide que pueden tener una mayor relevancia fisiológica.<br /

Hsp70 oligomerization is mediated by an interaction between the interdomain linker and the substrate-binding domain

Oligomerization in the heat shock protein (Hsp) 70 family has been extensively documented both in vitro and in vivo, although the mechanism, the identity of the specific protein regions involved and the physiological relevance of this process are still unclear. We have studied the oligomeric properties of a series of human Hsp70 variants by means of nanoelectrospray ionization mass spectrometry, optical spectroscopy and quantitative size exclusion chromatography. Our results show that Hsp70 oligomerization takes place through a specific interaction between the interdomain linker of one molecule and the substrate-binding domain of a different molecule, generating dimers and higher-order oligomers. We have found that substrate binding shifts the oligomerization equilibrium towards the accumulation of functional monomeric protein, probably by sequestering the helical lid sub-domain needed to stabilize the chaperone: substrate complex. Taken together, these findings suggest a possible role of chaperone oligomerization as a mechanism for regulating the availability of the active monomeric form of the chaperone and for the control of substrate binding and release

Multistep Inhibition of α-Synuclein Aggregation and Toxicity in Vitro and in Vivo by Trodusquemine.

The aggregation of α-synuclein, an intrinsically disordered protein that is highly abundant in neurons, is closely associated with the onset and progression of Parkinson's disease. We have shown previously that the aminosterol squalamine can inhibit the lipid induced initiation process in the aggregation of α-synuclein, and we report here that the related compound trodusquemine is capable of inhibiting not only this process but also the fibril-dependent secondary pathways in the aggregation reaction. We further demonstrate that trodusquemine can effectively suppress the toxicity of α-synuclein oligomers in neuronal cells, and that its administration, even after the initial growth phase, leads to a dramatic reduction in the number of α-synuclein inclusions in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson's disease, eliminates the related muscle paralysis, and increases lifespan. On the basis of these findings, we show that trodusquemine is able to inhibit multiple events in the aggregation process of α-synuclein and hence to provide important information about the link between such events and neurodegeneration, as it is initiated and progresses. Particularly in the light of the previously reported ability of trodusquemine to cross the blood-brain barrier and to promote tissue regeneration, the present results suggest that this compound has the potential to be an important therapeutic candidate for Parkinson's disease and related disorders