Avaliação histológica, ultraestrutural e molecular de córneas com ceratocone e dos efeitos do crosslinking rápido sobre os ceratócitos cultivados em modelo 3D

Purpose: Characterize healthy and keratoconus human corneas and keratocytes using histochemical, ultrastructural and molecular analysis and to evaluate the effects of crosslinking treatment at different times on healthy and KC keratocytes cultured in the 3D model. Methods: Cornea samples from control and KC patients were collected and processed for histological, biochemical, immunohistochemical and ultrastructural analyses. Primary keratocytes from control and KC corneas were isolated by collagenase digestion and cultured in DMEM/Ham\'s F12 medium supplemented with 2 % fetal bovine serum. After these cells reach the confluence state (~30 days), they were processed for Western blot analysis to evaluate protein levels implicated in cell structure, adhesion and signaling and an analysis of the lipid profile was performed. Cultured keratocytes were also subjected to CXL treatment at different times. After 24 hours viable cells were quantified by MTT and LDH techniques and apoptotic cells were counted using the caspase 3 marker. The levels of pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 and MMP-3, MMP-9 from the supernatants were tested by an enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). Results: Histological analysis showed that stroma from KC corneas presented disorganized collagen fibers compared to control samples. Picrosirius-polarization analysis demonstrated enhanced birefringence of collagen networks from control corneas compared to KC. Densitometry of yellow-red/ green birefringence of collagen fibers confirmed these findings and indicates a loss of collagen alignment in the KC. Ultrastructural analysis of KC cornea demonstrated loose fibrillar networks of stroma with small and thin collagen fibril diameters compared to the control samples. In addition, cultured KC cells showed reduced levels of vimentin, focal adhesion kinase (FAK), β1-integrin, keratocan and the activation of Src tyrosine. By contrast, lumican levels were increased in the KC cells and in the corneal stroma. In the analysis of the lipid profile, the potential biomarkers were shown to be completely different in cells with keratoconus compared to control cells (normal). After 24 hours of treatment with CXL, cell viability assessed by MTT and LDH assays indicated that there were no significant changes in the healthy and keratoconus groups. On the other hand, the immunofluorescence analysis showed increased levels of caspase 3 cleaved in healthy cells and keratoconus after 24 hours of treatment with CXL for 30 minutes. The quantification of the levels of pro-inflammatory cytokines IL- 8 and IL-6 and MMP-3 and -9 did not change. Conclusion: Our findings provide that KC is associated with a marked alteration of structural and molecular patterns of corneal stroma and keratocytes. This may be of significance for explanation of pathogenesis of corneal ectactic diseases.Objetivo: Caracterizar córneas e ceratócitos humano saudáveis (controle) e com ceratocone utilizando técnicas de análise histoquímica, ultraestrutural e molecular e avaliar os efeitos do tratamento de crosslinking em diferentes momentos em ceratócitos saudáveis e ceratócitos com ceratocone cultivados em modelo 3D. Métodos: Amostras de córnea de pacientes saudáveis e com ceratocone foram coletadas e processadas para análises histológicas, bioquímicas, imunohistoquímicas e ultraestruturais. Ceratócitos primários de córneas humanas saudáveis (controle) e com ceratocone foram isolados por digestão com colagenase e cultivadas em meio DMEM / Ham's F12 suplementado com 2% de soro fetal bovino. Após essas células atingirem o estado de confluência (~ 30 dias), elas foram processadas para análise de Western blot para avaliar os níveis de proteína implicados na estrutura celular, adesão e sinalização. Análise do perfil lipídico também foi realizada. Os ceratócitos cultivados foram submetidos ao tratamento CXL em diferentes momentos e após 24 horas as células viáveis foram quantificadas pelas técnicas de MTT e LDH e as células apoptóticas pelo marcador de caspase 3. Dos sobrenadantes foram testados por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) os níveis de citocinas pró-inflamatórias IL-6 e IL-8 e MMP-3 e MMP-9. Resultados: A análise histológica mostrou que o estroma das córneas com ceratocone apresenta fibras de colágeno desorganizadas em comparação com as amostras controle. A análise de picrosirius-polarization demonstrou birrefringência aumentada de redes de colágeno de córneas de controle em comparação com ceratocone. A densitometria da birrefringência amarelovermelho / verde das fibras de colágeno confirmou esses achados e indica uma perda do alinhamento do colágeno no ceratocone. A análise ultraestrutural da córnea com ceratocone demonstrou redes fibrilares soltas de estroma com diâmetros de fibrilas de colágeno pequenos e finos em comparação com as amostras de controle. Além disso, as células com ceratocone apresentaram níveis reduzidos de vimentina, quinase de adesão focal (FAK), integrina β1, keratocan e ativação da tirosina Src. Em contraste, os níveis de lumican foram aumentados nas células com ceratocone e no estroma corneal. Na análise do perfil lipídico, os potenciais biomarcadores demonstraram-se completamente diferentes nas células com ceratocone em comparação com as células controle (normais). Após 24 horas de tratamento com CXL, a viabilidade celular avaliada por ensaios de MTT e LDH indicaram que não houve alterações significativas nos grupos saudáveis e ceratocone. Por outro lado, a análise de imunofluorescência mostrou níveis aumentados de caspase 3 clivada nas células saudáveis e de ceratocone após 24 horas de tratamento com CXL de 30 minutos. A quantificação dos níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-8 e IL-6 e das MMP-3 e MMP-9 não apresentaram alterações. Conclusão: Nossos resultados indicam que o ceratocone está associado a uma alteração acentuada dos padrões estruturais e moleculares do estroma corneal e dos ceratócitos. Esses achados podem ser importantes para o entendimento da patogênese das ectasias corneais.Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2021

Comparação entre membrana amniótica com e sem epitélio como substrato para cultura de células epiteliais do limbo ex vivo

OBJETIVO: Avaliar a eficácia e aspecto estrutural de células límbicas epiteliais humanas cultivadas sobre membrana amniótica (MA) com e sem epitélio. MÉTODOS: As culturas límbicas foram obtidas a partir de rima corneoescleral remanescentes de transplantes de córnea de 6 diferentes doadores. Cada explante foi cultivado em três diferentes grupos: MA desepitelizada por tripsina (Grupo 1), MA com epitélio íntegro (Grupo 2) e controle (Grupo 3). A migração epitelial foi avaliada por microscopia de contraste de fase. Após 15 dias, as células cultivadas sobre MA foram submetidas à microscopia eletrônica para avaliar migração e adesão epitelial. RESULTADOS: Todas as células do grupo controle cresceram até atingir confluência. Somente uma das culturas em membrana amniótica desepitelizada não apresentou crescimento epitelial. O crescimento de células epiteliais sobre membrana amniótica epitelizada foi observada em apenas uma cultura. CONCLUSÃO: Baseando-se nestes achados, o uso de membrana amniótica desepitelizada aparenta ser o melhor substrato para migração e adesão epitelial comparando com membrana amniótica epitelizada. Remover o epitélio da membrana amniótica demonstra ser um importante passo para estabelecer culturas de células sobre membrana amniótica

Variação do volume de gotas de colírios lubrificantes disponíveis no mercado brasileiro

RESUMO Objetivo: Avaliar a variação intra e interexaminadores do volume de gotas dispensados de frascos de colírios lubrificantes disponíveis no mercado. Métodos: Foram estudados cinco frascos de colírios lubrificantes e dezenove voluntários participaram deste estudo. A massa média de gotas de 20µl dos colírios foi obtida utilizando micropipeta e balança de precisão e como padrão para comparação com a massa das gotas obtidas pelos voluntários. Cinco gotas de cada frasco foram pesadas individualmente com o tubo de colírio perpendicular à balança, usando o primeiro e segundo dedos da mão direita, de forma que a pressão fosse aplicada somente no meio do frasco. Os experimentos foram realizados em uma sala climatizada a temperatura ambiente (21±1°C). Resultados: Todos os frascos de colírios apresentaram variação estatisticamente significante das massas das gotas obtidas pelos examinadores quando comparadas com a massa média padrão de 0,0182±0,0014g, com exceção da comparação entre os dados do colírio A com o colírio D, que não apresentou variação estatisticamente significante. Conclusão: O presente estudo demonstra a ausência de uniformidade das gotas dispensadas pelos frascos de colírios disponíveis no mercado e a sua inadequação à real necessidade, uma vez que as gotas dispensadas são maiores do que o indicado. Esse fato torna-se um problema quando se trata de período de tratamento prolongado, especialmente com colírios dispendiosos como os indicados para a terapêutica do glaucoma. Nesse sentido, a padronização das gotas de colírios se faz necessária

Variation in the volume of lubricating eyedrops available in the brazilian market

<p></p><p>ABSTRACT Objective: To evaluate the intra and inter variations of eye drops volume dispensed from bottles available on the market. Methods: Five bottles of lubricant eye drops were studied and nineteen volunteers participated in this study. The average mass from 20µl of eye drops was obtained using accuracy micropipette and balance, and used as standard for comparison with the mass of the drops obtained by the volunteers. Five drops of each vial were individually weighed with the tube perpendicular to the balance, using the first and second fingers of the right hand, so that the pressure was applied only in the middle of the flask. The experiments were performed in a room temperature (21±1°C). Results: All eye drops bottles showed a statistically significant variation on masses of the drops obtained by examiners when compared with the standard average weight of 0.0182±0,0014g, except when compared A with D eye drops, with no statistically significant variation. Conclusion: This study demonstrates the lack of uniformity of drops dispensed by eye drops bottles available in the market and its inadequacy to the real need, since the dispensed drops are larger than indicated.This fact becomes a problem when it comes to long treatment period, especially with expensive drops as indicated for glaucoma therapy. In this sense, the standardization of drops of eye drops is necessary.</p><p></p

Comparison of culture media for ex vivo cultivation of limbal epithelial progenitor cells

Purpose: To compare the effectiveness of three culture media for growth, proliferation, differentiation, and viability of ex vivo cultured limbal epithelial progenitor cells.Methods: Limbal epithelial progenitor cell cultures were established from ten human corneal rims and grew on plastic wells in three culture media: supplemental hormonal epithelial medium (SHEM), keratinocyte serum-free medium (KSFM), and Epilife. The performance of culturing limbal epithelial progenitor cells in each medium was evaluated according to the following parameters: growth area of epithelial migration; immunocytochemistry for adenosine 5'-triphosphate-binding cassette member 2 (ABCG2), p63, Ki67, cytokeratin 3 (CK3), and vimentin (VMT) and real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for CK3, ABCG2, and p63, and cell viability using Hoechst staining.Results: Limbal epithelial progenitor cells cultivated in SHEM showed a tendency to faster migration, compared to KSFM and Epilife. Immunocytochemical analysis showed that proliferated cells in the SHEM had lower expression for markers related to progenitor epithelial cells (ABCG2) and putative progenitor cells (p63), and a higher percentage of positive cells for differentiated epithelium (CK3) when compared to KSFM and Epilife. In PCR analysis, ABCG2 expression was statistically higher for Epilife compared to SHEM. Expression of p63 was statistically higher for Epilife compared to SHEM and KSFM. However, CK3 expression was statistically lower for KSFM compared to SHEM.Conclusions: Based on our findings, we concluded that cells cultured in KSFM and Epilife media presented a higher percentage of limbal epithelial progenitor cells, compared to SHEM.Univ Fed Sao Paulo, CASO, Sao Paulo, BrazilUniv Fed Sao Paulo, Dept Ophthalmol, Cornea & External Dis Serv, Sao Paulo, BrazilUniv Fed Sao Paulo, CASO, Sao Paulo, BrazilUniv Fed Sao Paulo, Dept Ophthalmol, Cornea & External Dis Serv, Sao Paulo, BrazilWeb of Scienc