Etude de la diversité des récepteurs à l’acétylcholine chez les nématodes parasites comme cibles potentielles pour le développement de nouveaux anthelminthiques

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Functional investigation of nematode parasite specific acetylcholine receptors

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Étude de la diversité des récepteurs à l'acétylcholine chez les nématodes : de l’identification à la caractérisation fonctionnelle

Les récepteurs à l’acétylcholine (AChRs) des nématodes parasites sont des cibles pharmacologiques majeures pour les anthelminthiques utilisés en médecine vétérinaire. Cependant, face à l’émergence d’isolats résistants, l’optimisation des stratégies de lutte nécessite une meilleure connaissance du mode d’action des anthelminthiques et du répertoire d’AChRs pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Les nématodes parasites possèdent potentiellement une grande diversité d’AChR dont un nombre très restreint a été caractérisé fonctionnellement à ce jour. Dans ce contexte, nous avons identifié deux sous-unités d’AChR : ACR-26 et ACR-27 spécifiquement retrouvées chez les nématodes parasites. En exprimant ces sous-unités en œuf de Xénope et dans le nématode modèle Caenorhabditis elegans, nous avons mis en évidence un nouveau sous-type d’AChR musculaire sensible au morantel : le M-AChR. De plus, nous avons réalisé une étude moléculaire et fonctionnelle comparative des sous-unités d’AChR du groupe ACR-16 chez différentes espèces de nématodes. L’identification de ces nouveaux récepteurs constitue une base solide pour le développement de nouveaux anthelminthiques

Présentation technique micro-injection en oeufs de xénope

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The transcription factor NHR-8 is involved in ivermectin tolerance in the model nematode <em>Caenorhabditis elegans</em> and in the strongylid nematode <em>Haemonchus contortus</em>

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Effets des lactones macrocycliques sur les canaux chlorure glutamate-dépendant du nématode parasite du cheval Parascaris sp

Parascaris sp. est le plus grand nématode parasite des équins (chevaux, ânes, poneys…) et est responsable de l’ascaridiose équine. Cette maladie se traduit par des troubles digestifs et respiratoires chez l’animal pouvant conduire à sa mort. Le contrôle de ce parasite repose essentiellement sur l’utilisation d’anthelminthiques tels que les lactones macrocycliques (MLs). Cependant, le contrôle de l'infestation est de plus en plus difficile en raison de l’émergence de parasites résistants à travers le monde. Chez le nématode modèle Caenorhabditis elegans, les récepteurs canaux chlorure glutamate-dépendants (GluCls) ont été identifiés comme étant les cibles principales des MLs. Toutefois, chez Parascaris sp., le mode d'action des MLs reste largement méconnu. Dans cette étude, nous avons identifié les GluCls de Parascaris sp. et caractérisé l’effet d’une large gamme de MLs.En utilisant une approche de type gène-candidat, nous avons identifié les orthologues de 6 gènes codant pour des sous-unités de GluCls chez Parascaris sp. Les ADNc codant pour ces sous-unités ont été amplifiés par PCR et clonés dans un vecteur de transcription. Les ARNc correspondants ont été synthétisés in vitro puis microinjectés dans des ovocytes de Xenopus laevis. Des expériences de « two-electrode voltage-clamp » ont été effectuées sur des GluCls recombinants afin d'étudier leurs propriétés pharmacologiques. Ainsi, l’expression d’une seule sous-unité et la combinaison de différentes sous-unités dans les ovocytes de xénope nous ont permis d’obtenir les GluCls homériques et hétéromèriques fonctionnels de Parascaris sp. Les récepteurs étaient sensibles au glutamate et à l'ivermectine, mais présentaient des sensibilités très différentes face aux autres MLs appliquées. L’étude des fonctions physiologiques et l’impact des MLs sur ces récepteurs in vivo est en cours.Cette étude fournit une meilleure compréhension de la pharmacologie des GluCls ainsi que du mode d'action des lactones macrocycliques chez les nématodes parasites

Effect of macrocyclic lactones on <em>Parascaris sp.</em> glutamate-gated chloride channels

International audienceParascaris sp. is the largest parasitic nematode of horse causing digestive and respiratory disorders to the animal. The control of equine ascaridiosis relies on anthelmintic treatments including macrocyclic lactones (MLs) as the gold standard. However, control of infestation is increasingly difficult due to the emergence of resistant parasites throughout the world. In the free-living model nematode Caenorhabditis elegans, glutamate-dependent chloride channel receptors (GluCls) were identified as the main targets of MLs. However, in Parascaris sp, the mode of action of MLs remain poorly understood. Here we identified the Parascaris sp. GluCls and characterized the effect of a wide range of MLs. Using a candidate gene approach, we identified the orthologs of 6 genes encoding GluCls subunits in Parascaris sp. The complete cDNAs encoding these subunits were amplified by PCR and cloned into a transcription vector. The corresponding cRNAs were synthesized in vitro and then microinjected into Xenopus laevis oocytes. Two-electrode voltage-clamp experiments were performed on recombinant GluCls to investigate their pharmacological properties. Thus, the expression of a single subunit and combination of different subunits in Xenopus oocytes allowed us to obtain the functional homeric and heteromeric GluCls of Parascaris sp. The receptors were both sensitive to glutamate and ivermectin but the effect of seven different ML compounds revealed striking differences. The physiological function and the impact of MLs on these receptors in vivo are in progress. This study, provides a better understanding of the pharmacology of GluCls as well as the mode of action of MLs in nematode parasites

Functional characterization reveals preferential molecular targets of macrocyclic lactones in the horse nematode parasite <em>Parascaris sp</em>

National audienceParascaris sp. is the largest nematode parasite of horses and is responsible of equine ascaridiosis causing digestive and respiratory disorders to the animal. The fight against gastro-intestinal nematodes relies on anthelmintic treatments including macrocyclic lactones which are massively used worlwide to control human and veterinary parasites. However, control of infestation is increasingly difficult due to the emergence of resistant parasites throughout the world. The main targets of macrocyclic lactones in insects and nematodes have been identified as glutamate-gated chloride channel receptors (GluCls). However, in Parascaris sp, the mechanisms of action of macrocyclic lactones and the mechanisms of resistance remain largely unknown. First, using a candidate gene approach, we identified the orthologs of 5 genes encoding 6 GluCls subunits in Parascaris sp. The cDNAs of these subunits were amplified by PCR and cloned into a transcription vector. The corresponding cRNAs were synthesized in vitro and then microinjected into Xenopus laevis oocytes. This heterologous expression system is a powerfull tool to studied the composition and the pharmacology of recombinant receptors by recording currents after application of drugs (macrocyclic lactones) by two-electrode voltage-clamp. Thus, expression of the subunit singly or in combination in the xenopus oocytes allowed us to obtain the first functional caracterization of homeric and new heteromeric GluCl subtypes of Parascaris sp. All receptors identified are sensitive to glutamate but showed different affinity for macrocyclic lactones applied (ivermectin, moxidectin, selamectin, doramectin, emamectin, eprinomectin and abamectin). The physiological function and the impact of macrocyclic lactones on these receptors in vivo are in progress. In this study, we show the first functional characterization of Parascaris sp. GluCls sensitive to macrocyclic lactones. This research provides a better understanding of the pharmacology of GluCls as well as the mode of action of macrocyclic lactones

Nouvelles approches pour le contrôle des parasites résistants aux vermifuges

National audienceThe control of parasitic nematode infections in humans, livestock and companion animals is critically dependent on anthelmintic treatment. However, the indiscriminate use of anthelmintic drugs has inevitably led to the selection of resistant parasites. In this respect there is currently an urgent need to increase our knowledge on the mode of action of available anthelmintics as well as to identify novel targets for the development of next generation anthelmintic drugs.Les méthodes de luttes employées contre les nématodes parasites qui impactent la santé humaine ou animale sont remises en cause par l’émergence d’isolats capables de développer des résistances aux vermifuges (anthelminthiques). Dans ce contexte, la compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine de ce phénomène ainsi que l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques pour la découverte de nouveaux anthelminthiques sont indispensables au développement de stratégies de gestion du parasitisme efficaces et plus durables

Pharmacological characterization of novel heteromeric GluCl subtypes from C. elegans and parasitic nematodes

International audienceBackground and purpose: Macrocyclic lactones (MLs) are the most widely used broad-spectrum anthelmintic drugs for the treatment of parasitic nematodes impacting both human and animal health. MLs are known to act as agonist of the nematode glutamate-gated chloride channels (GluCls). However, for many important nematode species, the GluCls subunit composition and pharmacological properties remain largely unknown. In order to get new insights about the GluCl diversity and MLs mode of action, we identified and pharmacologically characterized receptors made of highly conserved GluCl subunits from the model nematode Caenorhabditis elegans, the human filarial nematode Brugia malayi and the horse parasite Parascaris univalens.Experimental approach: AVR-14, GLC-2, GLC3 and GLC-4 are the most conserved GluCl subunits throughout the Nematoda phylum. For each nematode species, we investigated the ability of these subunits to form either homomeric or heteromeric GluCls when expressed in Xenopus laevis oocytes and performed the detailed pharmacological characterization of the functional channels.Key results: Here, a total of 14 GluCls have been functionally reconstituted and heteromers formation was inferred from pharmacological criteria. Importantly, we report that the GLC-2 subunit plays a pivotal role in the composition of heteromeric GluCls in nematodes. In addition, we describe a novel GluCl subtype, made of the GLC-2/GLC-3 subunit combination, for which a high concentration of the anthelmintics ivermectin and moxidectin reversibly potentiate glutamate-induced response.Conclusion and implications: This study brings new insights into the diversity of GluCl subtypes in nematodes and promote novel drug targets for the development of next generation anthelmintic compounds