Study of the stress response capacity at the cellular level of the symbiotic Cnidaria Anemonia viridis

Au regard du rôle écologique majeur des Cnidaires symbiotiques dans l'écosystème marin côtier, il est essentiel de développer des approches cellulaires pour évaluer les capacités de résistance de ces organismes à différents stress. Ainsi, l'objectif de cette thèse a été de caractériser la réponse des cellules d'un Cnidaire symbiotique, l'anémone de mer, Anemonia viridis, à des stress extrinsèques liés à la pression anthropique, et intrinsèques liés aux contraintes de la vie en symbiose. En effet, le succès évolutif de la symbiose chez les Cnidaires est basé sur l'activité photosynthétique du symbiote (une microalgue de la famille des Symbiodiniacées), qui présente aussi des contraintes, comme une exposition journalière du tissu animal à des conditions pro-oxydantes du fait de la production d'O2 lors de la photosynthèse.Nous nous sommes d'abord intéressés à la capacité de réponse des cellules en culture d'A. viridis, à un stress lié à la pollution par des produits solaires. Un test innovant d'écotoxicologie marine in vitro basé sur le suivi de paramètres cellulaires, tels que la viabilité et la croissance, a permis d'évaluer l'écotoxicité de plusieurs types de produits solaires, à savoir : 1) des matières premières (e.g. filtres UV), Avobenzone et Benzophenone-3, présentant des EC50 en accord avec la littérature ; 2) des blocs de formulation et 3) des produits finis présentant une large gamme de réponses, validant la sensibilité de cette approche pour évaluer la toxicité de produits solaires sur l'écosystème marin côtier. Grâce à ce test et en alliant une stratégie préventive d'écoconception au sein de l'entreprise SOFIA Cosmétique, nous avons participé à la formulation d'une gamme de produits solaires plus écoresponsables.Puis, nous avons analysé la capacité d'A. viridis à répondre à des conditions pro-oxydantes par des approches in vivo et in vitro. Des spécimens entiers et des cultures cellulaires ont été soumis à 200 et 500μM H2O2 pendant 7 jours, puis nous avons mesuré des paramètres de santé globale (état symbiotique, viabilité et croissance cellulaire) et des biomarqueurs de stress (capacité antioxydante, dommages protéiques). À l'échelle de l'organisme entier, les deux concentrations d'H2O2 n'ont pas affecté la survie et les tissus animaux ont montré une grande résistance aux traitements. Aucun blanchissement n'a été observé chez les individus symbiotiques, seul le compartiment des symbiotes a présenté des dommages protéiques oxydatifs après une exposition à 500μM H2O2, malgré une augmentation de la capacité antioxydante globale. L'approche in vitro a montré une grande capacité intrinsèque des cellules animales à faire face à des conditions pro-oxydantes, bien que nous ayons observé des différences de tolérance aux deux traitements à l'H2O2 : 200μM d'H2O2 induit une seulement une diminution de la croissance cellulaire, alors que 500μM d'H2O2 induit un état de stress caractérisé par une diminution de la viabilité cellulaire et un arrêt drastique de la croissance cellulaire après 7 jours de traitement.Enfin, nous avons étudié la sénescence cellulaire induite par ces traitements sur une durée de 1 à 28 jours ou de façon répétée. Aucun traitement n'a induit de sénescence illustrant une capacité de résilience remarquable des cellules.Les travaux menés dans cette thèse ont ainsi validé l'utilisation de la culture cellulaire d'un Cnidaire symbiotique comme modèle biologique expérimental pour appréhender des questions fondamentales et appliquées. Ils ont par ailleurs permis i) le développement d'un projet entrepreneurial basé sur la commercialisation du test d'écotoxicité marine in vitro et ii) d'ouvrir la voie vers la caractérisation des mécanismes moléculaires et cellulaires liés à la capacité de résistance des Cnidaires symbiotiques à un stress oxydatif. Ces futures investigations à l'échelle cellulaire seront des atouts majeurs pour la compréhension des processus de longévité des Cnidaires.The objective of this thesis was to characterize the response of the cells of a symbiotic Cnidaria, the sea anemone, Anemonia viridis, to extrinsic stresses related to the anthropic pressure of coastal areas, and intrinsic stresses related to the constraints of living in symbiosis. Indeed, the evolutionary success of symbiosis in Cnidaria is based on the photosynthetic activity of the symbiont (a microalga of the Symbiodiniaceae family), which also presents constraints, such as a daily exposure of the animal tissue to pro-oxidant conditions due to the production of O2 during photosynthesis.We were first interested in the response capacity of cultured A. viridis cells to a stress related to pollution by solar products. An innovative in vitro marine ecotoxicology assay based on the monitoring of cell parameters, such as viability and growth, allowed us to evaluate the ecotoxicity of several types of sunscreen products, namely: 1) raw materials, namely the UV filters Avobenzone and Benzophenone-3, with EC50 values in agreement with the literature; 2) formulation blocks and 3) finished products with a wide range of responses, validating the sensitivity of this approach to assess the toxicity of sunscreen products on the coastal marine ecosystem. Thanks to this test and by combining a preventive strategy of eco-design within the company SO.F.I.A Cosmétiques, we participated in the formulation of a range of more eco-responsible sunscreen products.Subsequently, we analyzed the ability of A. viridis to respond to pro-oxidant conditions by in vivo and in vitro approaches. Whole specimens and cell cultures were subjected to 200 and 500μM H2O2 for 7 days, and then we measured global health parameters (symbiotic status, cell viability and growth) and stress biomarkers (antioxidant capacity, protein damage). At the whole organism level, both H2O2 concentrations did not affect survival and no bleaching was observed. Only the symbiont compartment exhibited oxidative protein damage after a 7-day exposure to 500μM H2O2, despite an increase in overall antioxidant capacity. The in vitro approach showed a high intrinsic capacity of animal cells to cope with pro-oxidative conditions, although we observed differences in tolerance: 200μM H2O2 induced only a decrease in cell growth with complete resilience, whereas 500μM H2O2 induced a stress state characterized by a decrease in cell viability, a drastic arrest of cell growth after 7 days of treatment, and partial resilience.Finally, we observed an absence of irreversible senescence phenotype (lysosomal ß-galactosidase activity) in cultured A. viridis cells following continuous (from 24 hours to 28 days) or repeated H2O2 treatments, as well as following resilience periods of several weeks. Similarly, an ionizing treatment up to 50 Gy did not induce senescence.During this work, we validated the use of a symbiotic Cnidaria cell culture as an experimental biological model to address fundamental and applied issues. This work paved the way for i) the development of an entrepreneurial project based on the commercialization of the in vitro marine ecotoxicity assay and ii) the characterization of molecular and cellular mechanisms related to the stress resistance capacity of symbiotic Cnidaria. These future investigations at the cellular scale will be major assets for the understanding of the longevity processes of Cnidaria

Étude de la capacité de réponse au stress à l'échelle cellulaire du Cnidaire symbiotique Anemonia viridis

The objective of this thesis was to characterize the response of the cells of a symbiotic Cnidaria, the sea anemone, Anemonia viridis, to extrinsic stresses related to the anthropic pressure of coastal areas, and intrinsic stresses related to the constraints of living in symbiosis. Indeed, the evolutionary success of symbiosis in Cnidaria is based on the photosynthetic activity of the symbiont (a microalga of the Symbiodiniaceae family), which also presents constraints, such as a daily exposure of the animal tissue to pro-oxidant conditions due to the production of O2 during photosynthesis.We were first interested in the response capacity of cultured A. viridis cells to a stress related to pollution by solar products. An innovative in vitro marine ecotoxicology assay based on the monitoring of cell parameters, such as viability and growth, allowed us to evaluate the ecotoxicity of several types of sunscreen products, namely: 1) raw materials, namely the UV filters Avobenzone and Benzophenone-3, with EC50 values in agreement with the literature; 2) formulation blocks and 3) finished products with a wide range of responses, validating the sensitivity of this approach to assess the toxicity of sunscreen products on the coastal marine ecosystem. Thanks to this test and by combining a preventive strategy of eco-design within the company SO.F.I.A Cosmétiques, we participated in the formulation of a range of more eco-responsible sunscreen products.Subsequently, we analyzed the ability of A. viridis to respond to pro-oxidant conditions by in vivo and in vitro approaches. Whole specimens and cell cultures were subjected to 200 and 500μM H2O2 for 7 days, and then we measured global health parameters (symbiotic status, cell viability and growth) and stress biomarkers (antioxidant capacity, protein damage). At the whole organism level, both H2O2 concentrations did not affect survival and no bleaching was observed. Only the symbiont compartment exhibited oxidative protein damage after a 7-day exposure to 500μM H2O2, despite an increase in overall antioxidant capacity. The in vitro approach showed a high intrinsic capacity of animal cells to cope with pro-oxidative conditions, although we observed differences in tolerance: 200μM H2O2 induced only a decrease in cell growth with complete resilience, whereas 500μM H2O2 induced a stress state characterized by a decrease in cell viability, a drastic arrest of cell growth after 7 days of treatment, and partial resilience.Finally, we observed an absence of irreversible senescence phenotype (lysosomal ß-galactosidase activity) in cultured A. viridis cells following continuous (from 24 hours to 28 days) or repeated H2O2 treatments, as well as following resilience periods of several weeks. Similarly, an ionizing treatment up to 50 Gy did not induce senescence.During this work, we validated the use of a symbiotic Cnidaria cell culture as an experimental biological model to address fundamental and applied issues. This work paved the way for i) the development of an entrepreneurial project based on the commercialization of the in vitro marine ecotoxicity assay and ii) the characterization of molecular and cellular mechanisms related to the stress resistance capacity of symbiotic Cnidaria. These future investigations at the cellular scale will be major assets for the understanding of the longevity processes of Cnidaria.Au regard du rôle écologique majeur des Cnidaires symbiotiques dans l'écosystème marin côtier, il est essentiel de développer des approches cellulaires pour évaluer les capacités de résistance de ces organismes à différents stress. Ainsi, l'objectif de cette thèse a été de caractériser la réponse des cellules d'un Cnidaire symbiotique, l'anémone de mer, Anemonia viridis, à des stress extrinsèques liés à la pression anthropique, et intrinsèques liés aux contraintes de la vie en symbiose. En effet, le succès évolutif de la symbiose chez les Cnidaires est basé sur l'activité photosynthétique du symbiote (une microalgue de la famille des Symbiodiniacées), qui présente aussi des contraintes, comme une exposition journalière du tissu animal à des conditions pro-oxydantes du fait de la production d'O2 lors de la photosynthèse.Nous nous sommes d'abord intéressés à la capacité de réponse des cellules en culture d'A. viridis, à un stress lié à la pollution par des produits solaires. Un test innovant d'écotoxicologie marine in vitro basé sur le suivi de paramètres cellulaires, tels que la viabilité et la croissance, a permis d'évaluer l'écotoxicité de plusieurs types de produits solaires, à savoir : 1) des matières premières (e.g. filtres UV), Avobenzone et Benzophenone-3, présentant des EC50 en accord avec la littérature ; 2) des blocs de formulation et 3) des produits finis présentant une large gamme de réponses, validant la sensibilité de cette approche pour évaluer la toxicité de produits solaires sur l'écosystème marin côtier. Grâce à ce test et en alliant une stratégie préventive d'écoconception au sein de l'entreprise SOFIA Cosmétique, nous avons participé à la formulation d'une gamme de produits solaires plus écoresponsables.Puis, nous avons analysé la capacité d'A. viridis à répondre à des conditions pro-oxydantes par des approches in vivo et in vitro. Des spécimens entiers et des cultures cellulaires ont été soumis à 200 et 500μM H2O2 pendant 7 jours, puis nous avons mesuré des paramètres de santé globale (état symbiotique, viabilité et croissance cellulaire) et des biomarqueurs de stress (capacité antioxydante, dommages protéiques). À l'échelle de l'organisme entier, les deux concentrations d'H2O2 n'ont pas affecté la survie et les tissus animaux ont montré une grande résistance aux traitements. Aucun blanchissement n'a été observé chez les individus symbiotiques, seul le compartiment des symbiotes a présenté des dommages protéiques oxydatifs après une exposition à 500μM H2O2, malgré une augmentation de la capacité antioxydante globale. L'approche in vitro a montré une grande capacité intrinsèque des cellules animales à faire face à des conditions pro-oxydantes, bien que nous ayons observé des différences de tolérance aux deux traitements à l'H2O2 : 200μM d'H2O2 induit une seulement une diminution de la croissance cellulaire, alors que 500μM d'H2O2 induit un état de stress caractérisé par une diminution de la viabilité cellulaire et un arrêt drastique de la croissance cellulaire après 7 jours de traitement.Enfin, nous avons étudié la sénescence cellulaire induite par ces traitements sur une durée de 1 à 28 jours ou de façon répétée. Aucun traitement n'a induit de sénescence illustrant une capacité de résilience remarquable des cellules.Les travaux menés dans cette thèse ont ainsi validé l'utilisation de la culture cellulaire d'un Cnidaire symbiotique comme modèle biologique expérimental pour appréhender des questions fondamentales et appliquées. Ils ont par ailleurs permis i) le développement d'un projet entrepreneurial basé sur la commercialisation du test d'écotoxicité marine in vitro et ii) d'ouvrir la voie vers la caractérisation des mécanismes moléculaires et cellulaires liés à la capacité de résistance des Cnidaires symbiotiques à un stress oxydatif. Ces futures investigations à l'échelle cellulaire seront des atouts majeurs pour la compréhension des processus de longévité des Cnidaires

Intrinsically High Capacity of Animal Cells From a Symbiotic Cnidarian to Deal With Pro-Oxidative Conditions

International audienceThe cnidarian-dinoflagellate symbiosis is a mutualistic intracellular association based on the photosynthetic activity of the endosymbiont. This relationship involves significant constraints and requires co-evolution processes, such as an extensive capacity of the holobiont to counteract pro-oxidative conditions induced by hyperoxia generated during photosynthesis. In this study, we analyzed the capacity of Anemonia viridis cells to deal with pro-oxidative conditions by in vivo and in vitro approaches. Whole specimens and animal primary cell cultures were submitted to 200 and 500 μM of H 2 O 2 during 7 days. Then, we monitored global health parameters (symbiotic state, viability, and cell growth) and stress biomarkers (global antioxidant capacity, oxidative protein damages, and protein ubiquitination). In animal primary cell cultures, the intracellular reactive oxygen species (ROS) levels were also evaluated under H 2 O 2 treatments. At the whole organism scale, both H 2 O 2 concentrations didn’t affect the survival and animal tissues exhibited a high resistance to H 2 O 2 treatments. Moreover, no bleaching has been observed, even at high H 2 O 2 concentration and after long exposure (7 days). Although, the community has suggested the role of ROS as the cause of bleaching, our results indicating the absence of bleaching under high H 2 O 2 concentration may exculpate this specific ROS from being involved in the molecular processes inducing bleaching. However, counterintuitively, the symbiont compartment appeared sensitive to an H 2 O 2 burst as it displayed oxidative protein damages, despite an enhancement of antioxidant capacity. The in vitro assays allowed highlighting an intrinsic high capacity of isolated animal cells to deal with pro-oxidative conditions, although we observed differences on tolerance between H 2 O 2 treatments. The 200 μM H 2 O 2 concentration appeared to correspond to the tolerance threshold of animal cells. Indeed, no disequilibrium on redox state was observed and only a cell growth decrease was measured. Contrarily, the 500 μM H 2 O 2 concentration induced a stress state, characterized by a cell viability decrease from 1 day and a drastic cell growth arrest after 7 days leading to an uncomplete recovery after treatment. In conclusion, this study highlights the overall high capacity of cnidarian cells to cope with H 2 O 2 and opens new perspective to investigate the molecular mechanisms involved in this peculiar resistance