Lignocellulosic biomass hydrolysis using novel microbial biocatalysts for efficient biofuel production

The present Ph.D. thesis has to do with the enzymatic hydrolysis processes of pretreated lignocellulosic biomass at high initial solids content for the production of biofuels and especially bioethanol. Moreover, the production, biochemical characterization and technological evaluation of four novel enzymes, a xylanase and a mannanase from the thermophilic ascomycete Myceliophthora thermophila, and two glucuronoyl esterases from basidiomycetes Artolenzites elegans and Trametes ljubarskyi, were also conducted.Corn stover was the main source of lignocellulosic biomass, while in some cases beechwood sawdust was also utilized. The biomass was milled and subsequently underwent a pretreatment step in order to become vulnerable to enzymatic hydrolysis. The employed pretreatment processes were acetic acid-catalyzed hydrothermal pretreatment, steam explosion with and without the addition of an acid catalyst (H2SO4), organosolv pretreatment using a mixture of ethanol/water, and acetone/water oxidation. The assessment and selection of different pretreatment conditions in each case were conducted with glucose release and ethanol concentration as response factors. Furthermore, the effects of enzyme loading and initial solids concentration on cellulose conversion were investigated.Consequently, the pretreated biomasses underwent a liquefaction/ saccharification step at high solids content prior to simultaneous saccharification and fermentation process employing a custom made free-fall mixer. Maximum ethanol concentration and yield were found to be 76 g/L and 78 %, respectively, which are among the highest values reported in the literature. Moreover, the fermentation residues were used to produce biomethane in an attempt to enhance the energy efficiency of the whole process in the frame of the biorefinery concept.A second, complementary to the first, part this thesis, is the discovery of novel enzymes of high industrial and biotechnological interest. Such enzymes comprise a crucial step towards the improvement of the enzymatic arsenal against defense mechanisms of plant cell wall. The genes coding the desired enzymes were selected after an in silico analysis of lignocellulolytic microorganisms’ genomes. The genes were cloned and functionally expressed using the heterologous expression system of the methylotrophic yeast Pichia pastoris X33 and the biochemical characteristics, substrate specificity, and kinetic constants were determined for each recombinant protein.In the case of glucuronoyl esterases (AeGE15 και TlGE15), the biochemical characterization was carried out using a synthetic phenyl ester of D-glucuronic acid in an attempt to elucidate their role in plant cell wall degradation. The enzymatically prepared cinnamyl-D-glucuronate mimics bonds naturally occurring in the complex matrix of plant cell wall. Furthermore, the synergistic action of a recombinant GH26 mannanase (MtMan26A) with a commercial cellulolytic enzymatic cocktail was examined. The addition of MtMan26A led to an improvement in glucose release from lignocellulosic biomass by 12 %. Finally, the endoxylanase from M. thermophila (MtXyn30A) was found to be an appendage-dependent glucuronoxylan hydrolase, recognizing 4-O-methyl-D-glucuronic as substrate specificity determinant. This interesting property allows the enzyme to be used for the production of branched acidic xylooligosaccharides, which are known not only for their prebiotic action but also for their beneficial effects on human health.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εξετάστηκαν διεργασίες ενζυμικής υδρόλυσης προκατεργασμένης λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας σε υψηλές αρχικές συγκεντρώσεις στερεών με σκοπό την παραγωγή βιοκαυσίμων, με ιδιαίτερη έμφαση στη βιοαιθανόλη. Επιπλέον, μελετήθηκε η παραγωγή, ο βιοχημικός χαρακτηρισμός και η τεχνολογική αξιοποίηση τεσσάρων καινοτόμων ενζύμων, μιας ξυλανάσης και μιας μαννανάσης από το θερμόφιλο ασκομύκητα Myceliophthora thermophila και δύο εστερασών του γλυκουρονικού οξέος της ημικυτταρίνης από τους βασιδιομύκητες Artolenzites elegans και Trametes ljubarskyi. Η κύρια πηγή λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας που χρησιμοποιήθηκε ήταν τα στελέχη αραβόσιτου ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν και ρινίσματα ξύλου οξιάς. Αφού η βιομάζα οδηγήθηκε στην επιθυμητή κοκκομετρία μέσω άλεσης, οι μέθοδοι προκατεργασίας που αξιολογήθηκαν, προκειμένου αυτή να καταστεί ευάλωτη στο μετέπειτα στάδιο της ενζυμικής υδρόλυσης, ήταν η υδροθερμική προκατεργασία ενισχυμένη με αραιό οξικό οξύ, η έκρηξη ατμού με και χωρίς την προσθήκη θειικού οξέος, η προκατεργασία organosolv με χρήση μίγματος νερού/ αιθανόλης και η υγρή οξείδωση με χρήση μίγματος ακετόνης/ νερού. Η αξιολόγηση και η επιλογή των συνθηκών προκατεργασίας πραγματοποιήθηκε με παράγοντες απόκρισης την απελευθέρωση γλυκόζης κατά την ενζυμική υδρόλυση και την παραγωγή αιθανόλης σε κάθε περίπτωση. Επίσης, μελετήθηκαν η επίδραση του ενζυμικού φορτίου και η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης στερεών στη μετατροπή της κυτταρίνης σε γλυκόζη.Στη συνέχεια η προκατεργασμένη, στις επιλεχθείσες συνθήκες, βιομάζα οδηγήθηκε σε διεργασία παραγωγής αιθανόλης ταυτόχρονης σακχαροποίησης και ζύμωσης με ενσωματωμένο ένα προγενέστερο στάδιο ρευστοποίησης/ σακχαροποίησης σε υψηλή συγκέντρωση στερεών με τη βοήθεια αυτοσχέδιου αναμεικτήρα ελεύθερης πτώσης. Η εφαρμογή της παραπάνω διεργασίας σε συνδυασμό με την προκατεργασμένη, στις βέλτιστες συνθήκες, βιομάζα οδήγησε σε υψηλές συγκεντρώσεις αιθανόλης έως και 76 g/L, καθώς και σε υψηλές αποδόσεις (78 %). Ακόμα, υπολείμματα της αλκοολικής ζύμωσης χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή βιομεθανίου σε μια προσπάθεια ενίσχυσης της ενεργειακής απόδοσης της διεργασίας στα πλαίσια ενός βιοδιυλιστηρίου. Η ανακάλυψη καινοτόμων ενζύμων με ιδιότητες που τα καθιστούν υψηλού βιομηχανικού και τεχνολογικού ενδιαφέροντος αποτελεί σημαντικό βήμα προς την ενίσχυση του ενζυμικού οπλοστασίου εναντίον των μηχανισμών άμυνας του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος. Η επιλογή των γονιδίων που κωδικοποιούν τα επιθυμητά ένζυμα πραγματοποιήθηκε μετά από in silico ανάλυση των γονιδιωμάτων των μικροοργανισμών. Τα γονίδια κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν λειτουργικά μέσω του συστήματος ετερόλογης έκφρασης της μεθυλότροφης ζύμης Pichia pastoris X33. Ακολούθησε προσδιορισμός των βιοχημικών χαρακτηριστικών των ανασυνδυασμένων ενζύμων, πλήρης χαρακτηρισμός της εξειδίκευσης υποστρώματος, καθώς και προσδιορισμός των κινητικών σταθερών. Στην περίπτωση των εστερασών του γλυκουρονικού οξέος (AeGE15 και TlGE15), ο βιοχημικός χαρακτηρισμός και η κινητική μελέτη πραγματοποιήθηκαν με χρήση ενός συνθετικού, ανάλογου των φυσικών, υποστρώματος, του εστέρα της κινναμυλικής αλκοόλης με D-γλυκουρονικό οξύ. Η συγκεκριμένη κινητική μελέτη αποτέλεσε μια εκ των πρώτων μελετών όπου χρησιμοποιήθηκε φαινολικός εστέρας του D-γλυκουρονικού οξέος, συμβάλλοντας στην προσπάθεια διαλεύκανσης του ρόλου των εστερασών του γλυκουρονικού οξέος στην αποικοδόμηση του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος.Επιπλέον, μελετήθηκε η συνεργιστική δράση μεταξύ της ανασυνδυασμένης μαννανάσης της οικογένειας GH26 (MtMan26A) και εμπορικού κυτταρινολυτικού σκευάσματος. Η προσθήκη της MtMan26A είχε ως αποτέλεσμα την ενίσχυση της ενζυμικής υδρόλυσης λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας αυξάνοντας την απελευθέρωση γλυκόζης κατά 12 %. Εν τέλει, η ξυλανάση της οικογένειας GH30 (MtXyn30A) χρησιμοποιήθηκε για την επιτυχή υδρόλυση γλυκουρονοξυλάνης ξύλου οξιάς, καθώς και για την παραγωγή όξινων ξυλοολιγοσακχαριτών οι οποίοι είναι γνωστοί τόσο για την πρεβιοτική τους δράση όσο και για τις ευεργετικές τους ιδιότητες στον ανθρώπινο οργανισμό

Enzymatic synthesis of novel substrates for the characterization of glucuronoyl esterases

116 σ.Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η δράση της εστεράσης του γλυκουρονικού οξέος από το θερμόφιλο μύκητα Sporotrichum thermophile σε συνθετικά ανάλογα των φυσικών υποστρωμάτων και πιο συγκεκριμένα σε φαινυλεστέρες του γλυκουρονικού οξέος. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε παραγωγή και απομόνωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης StGE2 από μετασχηματισμένα κύτταρα του ζυμομύκητα P. pastoris. Η παραγωγή πραγματοποιήθηκε με υγρές καλλιέργειες των κυττάρων της ζύμης, η απομόνωση έγινε με στάδια διηθήσεων, συμπύκνωσης και χρωματογραφίας συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου (IMAC) και τέλος το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε μέσω ηλεκτροφόρησης πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) στα 43 kDa. Στη συνέχεια ακολούθησε η ενζυμική σύνθεση και ο καθαρισμός τριών εστέρων του D-γλυκουρονικού οξέος της 3-φαινυλ-1-προπανόλης, της κινναμικής αλκοόλης και της 3-(4-υδροξυφαινυλ)-1-προπανόλης. Η σύνθεση των εστέρων πραγματοποιήθηκε ενζυμικά χρησιμοποιώντας ως βιοκαταλύτη τη λιπάση Novozym 435, ο καθαρισμός έγινε με εκχύλιση και χρωματογραφία πηκτής διοξειδίου του πυριτίου (silica gel chromatography), ενώ η ταυτοποίηση των εστέρων πραγματοποιήθηκε μέσω φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Η κινητική μελέτη της δράσης της εστεράσης του γλυκουρονικού οξέος StGE2 στα συνθετικά υποστρώματα οδήγησε στον υπολογισμό των σταθερών Michaelis-Menten Km και kcat, καθώς και του λόγου kcat / Km ο οποίος αποτελεί ένδειξη για την προτίμηση του ενζύμου ως προς το υπόστρωμα. Ο υπολογισμός πραγματοποιήθηκε με ποσοτικό προσδιορισμό της απελευθέρωσης των φαινολικών αλκοολών 3-φαινυλ-1-προπανόλη, κινναμική αλκοόλη και 3-(4-υδροξυφαινυλ)-1-προπανόλη κατά την υδρόλυση των υποστρωμάτων από την StGE2 με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Για το σκοπό αυτό καταστρώθηκε αναλυτική μέθοδος HPLC όπου με δοκιμές προέκυψε ο κατάλληλος διαλύτης έκλουσης και έπειτα κατασκευάστηκαν οι καμπύλες αναφοράς των αλκοολών. Από την σύγκριση του λόγου kcat / Km μεταξύ των υποστρωμάτων προσδιορίσθηκε ότι ο εστέρας της κινναμικής αλκοόλης υδρολύεται ταχύτερα χωρίς όμως η εστεράση να επιδεικνύει υψηλή συγγένεια ως προς τα υποστρώματα. Τέλος, για την παραγωγή νέων συνθετικών υποστρωμάτων τα οποία να βρίσκονται πιο κοντά στα φυσικά, έγινε προσπάθεια απομόνωσης 4-Ο-μεθυλ-D-γλυκουρονικού οξέος από γλυκουρονοξυλάνη σημύδας προκειμένου να χρησιμοποιηθεί ως αντιδρόν στις ενζυμικές συνθέσεις των φαινυλεστέρων αντί του D-γλυκουρονικού οξέος. Για πρώτη φορά, πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της δράσης μιας εστεράσης του γλυκουρονικού οξέος σε φαινολικούς εστέρες του αντίστοιχου οξέος συμβάλλοντας έτσι στην προσπάθεια διαλεύκανσης του ρόλου αυτών των ενζύμων στην αποικοδόμηση των φυτικών κυτταρικών τοιχωμάτων.The present diploma thesis examines the action of a glucuronoyl esterase from the thermophilic fungus Sporotrichum thermophile on three synthetic compounds that mimic the ester linkages of natural substrates and more specifically on esters of D-glucuronic acid with phenyl alcohols. Recombinant glucuronoyl esterase StGE2 was produced in Pichia pastoris using liquid cell cultures. For the purification of the recombinant protein, culture broth was centrifuged, filtrated and concentrated and subsequently the protein was purified using immobilized metal-ion affinity chromatography (IMAC). Both the homogeneity and the molecular weight of the purified StGE2 were assessed by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) with the latter estimated to be 43 kDa. Esters of D-glucuronic acid with 3-phenyl-1-propanol, cinnamyl alcohol and 3-(4-hydroxyphenyl)-1-propanol were prepared by using immobilized Candida antarctica Lipase B in organic medium. The glucuronates, containing a UV-absorbing chromophore, were purified by filtration, extraction and silica gel chromatography and characterized by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). The catalytic properties of the purified glucuronoyl esterase StGE2 on all three substrates were examined by determining the Km, kcat and kcat/Km values. The determination of kinetic parameters was carried out on all esters by using a quantitative assay which was based on the measurement of the increase of phenyl alcohols by following the enzymatic de-esterification by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with a spectrophotometric detector. The elution solvent was determined through trials and alcohols standard curves were prepared by using the same assay. The StGE2 exhibited higher affinity and catalytic efficiency for cinnamyl glucuronate than for the other esters. For the synthesis of new, more specialized substrates, purification of 4-O-methyl-D-glucuronic acid from birch glucuronoxylan was carried out in order to take the place of D-glucuronic acid as reactant in enzymatic esterification with each of the three phenyl alcohols. This is the first time that a glucuronoyl esterase’s kinetic action on phenyl esters of D-glucuronic acid is examined, making a step towards the unraveling of such enzymes’ role in plant cell wall degradation.Κωνσταντίνος Η. Κατσίμπουρα

MOESM1 of Production of high concentrated cellulosic ethanol by acetone/water oxidized pretreated beech wood

Additional file 1: Figure S1. FTIR spectra of standard Kraft lignin, Milox [32] derived lignin and acetone/water oxidation lignin

MOESM2 of Production of high concentrated cellulosic ethanol by acetone/water oxidized pretreated beech wood

Additional file 2: Figure S2. Free-fall mixer that was employed for the liquefaction/saccharification of AWOBW run no. 10 at high-solids content (20 wt%). (a) Front view, (b) top view, (c) inside view, and AWOBW slurry (d) before and (e) after the liquefaction/saccharification step. Free-fall mixer was designed and constructed by Paschos et al. [19], and was funded by the European Community’s 7th Framework Program (Project ID 213139; the HYPE project)

Enzymatic synthesis of model substrates recognized by glucuronoyl esterases from [i]Podospora anserina[/i] and [i]Myceliophthora thermophila[/i]

Glucuronoyl esterases (GEs) are recently discovered enzymes that are suggested to cleave the ester bond between lignin alcohols and xylan-bound 4-O-methyl-d-glucuronic acid. Although their potential use for enhanced enzymatic biomass degradation and synthesis of valuable chemicals renders them attractive research targets for biotechnological applications, the difficulty to purify natural fractions of lignin-carbohydrate complexes hampers the characterization of fungal GEs. In this work, we report the synthesis of three aryl alkyl or alkenyl d-glucuronate esters using lipase B from Candida antarctica (CALB) and their use to determine the kinetic parameters of two GEs, StGE2 from the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila (syn. Sporotrichum thermophile) and PaGE1 from the coprophilous fungus Podospora anserina. PaGE1 was functionally expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under the transcriptional control of the alcohol oxidase (AOX1) promoter and purified to its homogeneity (63 kDa). The three d-glucuronate esters contain an aromatic UV-absorbing phenol group that facilitates the quantification of their enzymatic hydrolysis by HPLC. Both enzymes were able to hydrolyze the synthetic esters with a pronounced preference towards the cinnamyl-d-glucuronate ester. The experimental results were corroborated by computational docking of the synthesized substrate analogues. We show that the nature of the alcohol portion of the hydrolyzed ester influences the catalytic efficiency of the two GEs