Molekularbiologische Untersuchung der Diversität von Mikroorganismen in gefluteten und ungefluteten Pappelmikrokosmen

Auenböden unterliegen aufgrund temporärer Flutungen einem starken Wechsel im Wassergehalt. Als Folge adaptieren sich Pflanzen, wie beispielsweise Pappeln, und Mikroorganismen an diese anoxischen Bedingungen. Ziel dieser Arbeit war es die Auswirkungen von Flutung auf die mikrobiellen Lebensgemeinschaften (Bacteria und Archaea), die mit Pappeln assoziiert sind, in Mikrokosmen zu analysieren. Die Struktur der Lebensgemeinschaften wurde mittels terminaler Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (T-RFLP)-Analyse, Klonierung und vergleichender Sequenzierung der 16S rRNA-codierenden Gene (16S rDNA) aufgeklärt. Durch Inkubation (90 Tage) von undurchwurzelten Bodenproben aus ungefluteten (bodenfeuchten) und vorgefluteten Pappelmikrokosmen sowie aus feldfrischen Proben wurde ein Überblick der biogeochemischen Prozesse erhalten. Nach Aufschlämmung dieser Proben wurden die vorhandenen Elektronenakzeptoren entsprechend ihrem Redoxpotential sequentiell reduziert. Im Vergleich unterschieden sich die Proben aus den Mikrokosmen von denen der feldfrischen Proben hinsichtlich der Konzentrationen der ermittelten Parameter, insbesondere war die Methanbildung in den feldfrischen Proben wesentlich stärker ausgeprägt. Die bakteriellen Lebensgemeinschaften in Bodenproben aus vorgefluteten und ungefluteten Mikrokosmen veränderten sich kaum mit der Zeit und wurden von Bacillales und Acidobacteria, welche typisch für Böden sind, dominiert. In den feldfrischen Proben waren zusätzlich Actinobacteria und Alphaproteobacteria dominant. Die archaeelle Lebensgemeinschaft zeigte über den untersuchten Zeitraum in allen Ansätzen geringe Veränderungen. Die abundanten Gruppen innerhalb der Archaea zählten zu den nicht kultivierten Crenarchaeota der Linie 1.1b und den Methanosarcinaceae. Zum Ende der Inkubationen wurden mit abnehmender Acetatkonzentration Methanosaetaceae detektiert. Weiterhin wurde der Einfluss der Pappelpflanze auf die mikrobiellen Gemeinschaften durch die Analyse der Kompartimente undurchwurzelter Boden, Rhizosphäre und Rhizoplane in einem weiteren Mikrokosmosexperiment untersucht. Für die bakterielle Gemeinschaft wurde eine Gesamtheit von 281 Klonsequenzen erhalten. Die Anzahl der verschiedenen Sequenzen (<97 % Ähnlichkeit) in den verschiedenen Habitaten repräsentierte jeweils zwischen 16-55 % des gesamten bakteriellen Artenreichtums wie sie mit Chao1 als Indikator abgeschätzt wurde. In Bezug auf die Anzahl der verschiedenen terminalen Restriktionsfragmente zeigten alle Habitate jeweils ca. 20 verschiedene „operational taxonomic units“ (OTUs), mit Ausnahme des Habitats der gefluteten Rhizoplane, welches eine geringere Anzahl an OTUs aufwies. Generell bestätigten sich die mittels Klonierung und T-RFLP-Analyse erzielten Ergebnisse gegenseitig. Die statistische Auswertung der gesamten T-RFLP-Profile mittels Korrespondenzanalyse zeigte, dass sich die bakteriellen Gemeinschaften in den Kompartimenten deutlich voneinander unterschieden und sich durch Flutung veränderten. Beispielsweise traten unter ungefluteten Bedingungen Bacillus spp. vermehrt im undurchwurzelten Boden und in der Rhizosphäre auf. Hingegen waren Bakterien in nächster Verwandtschaft zu Aquaspirillum sp. nur an Pappelwurzeln und in der Rhizosphäre von gefluteten Mikrokosmen abundant. Die archaeelle Gemeinschaft wurde in allen Kompartimenten, sowohl geflutet als auch ungeflutet, zu 99 % von Crenarchaeota-Klonsequenzen der Linie 1.1b dominiert. Die Dominanz crenarchaeotischer Linien in den Bodenaufschlämmungen und allen Kompartimenten der Mikrokosmen weist auf ihre physiologische Bedeutung nicht nur in Böden, sondern auch in der Rhizosphäre und an Wurzeln von Pappelpflanzen hin. Allein zwei Klonsequenzen aus dem Habitat der Rhizoplane wurden bisher unkultivierten Euryarchaeota zugeordnet. Im Gegensatz zu den Bodenaufschlämmungen wurden keine Methanogenen mittels Klonierung detektiert. In dieser Arbeit wurden erstmals in dem System der Pappelmikrokosmen Einblicke in die strukturelle Zusammensetzung der Bacteria und Archaea, auch in Abhängigkeit von Flutung, mit Hilfe molekularbiologischer Methoden erhalten und abundante Mikroorganismen konnten identifiziert werden. Dies stellt eine Basis für gezielte physiologische Fragestellungen in diesem Habitat dar

Rice plants, drainage and crop rotation influence the methanogenic community in rice field soil

Reisfelder zeichnen sich durch Flutung während des Reisanbaus aus, was die Bildung von anoxischen Nischen begünstigt. In diesen Nischen findet der anaerobe Abbau von organischem Material bis hin zur Bildung von Methan durch methanogene Archaeen statt. Ein wesentlicher Teil des organischen Materials in Reisfeldern stammt von der Reispflanze selbst, welche Kohlenstoffverbindungen über ihr Wurzelsystem ausscheidet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss der Reispflanze auf die mikrobielle Gemeinschaft im Boden untersucht. Die bakterielle Gemeinschaft unterschied sich dabei nur geringfügig in ihrer Zusammensetzung zwischen bepflanztem und unbepflanztem Reisfeldboden. Dabei zeigten unter anderem Geobacter und Opitutus eine höhere Abundanz im bepflanzten Boden. Während sich die Anzahl der Bakterien und der Archaeen im bepflanzten Boden verdoppelte, zeigte die Zusammensetzung der archaeellen Gemeinschaft wenig Veränderung. Zusammengefasst zeigten die Ergebnisse jedoch, dass die mikrobielle Gemeinschaft im Reisfeldboden stark an die Reispflanze und deren Wurzelexudation adaptiert ist. Aufgrund der stetig steigenden Weltbevölkerung ist ein Anstieg der Nachfrage für Ressourcen wie Wasser anzunehmen. Dies könnte eine eingeschränkte Verfügbarkeit an Wasser für den Reisanbau zur Folge haben. Alternative Anbaustrategien, die eine Reduzierung des Wasserverbrauchs im Vergleich zum konventionellen Reisanbau ermöglichen, rücken somit immer mehr in den Fokus. Der Fruchtfolgewechsel mit einer Pflanze wie Mais, die unter nicht gefluteten Feldbedingungen wächst, ist eine dieser Optionen. Der zweite Teil dieser Arbeit unterteilt sich daher in zwei Schwerpunkte: Unter Feldbedingungen wurde der Einfluss (I) der Wachstumsstadien der Reispflanze sowie (II) der von Feldbearbeitungsmaßnahmen wie der Dränage und dem Anbau von Mais unter nicht gefluteten Bedingungen auf die mikrobielle Gemeinschaft im Reisfeldboden untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass sich die Wachstumsstadien der Reispflanze nur begrenzt auf die Zusammensetzung und Aktivität der Mikroben auswirkten. Im Gegensatz dazu führten Dränage und der Anbau von Mais zu einer Abnahme der Abundanz der Mikroben. Desweiteren zeigten verschiedene bakterielle Gruppen eine Reaktion auf die Feldbearbeitungsmaßnahmen indiziert durch eine erhöhte relative Abundanz in den nicht gefluteten Feldern. Diese unterteilten sich in zwei Gruppen: (I) aerobe Organismen wie Spartobacteria und Sphingobacteria und (II) Bakterien, die unter substratlimitierten Bedingungen wachsen, wie Bacteroidetes und Acidobacteria. Im Gegensatz dazu blieb die archaeele Gemeinschaft weitestgehend unbeeinflusst. Interessanterweise wurden innerhalb der Ordnung der Methanosarcinales eine große Anzahl an GOM Arc I Spezies gefunden, die potentiell zur anaeroben Methanoxidation fähig sind. Desweiteren, wurde während der nicht gefluteten Bedingungen beobachtet, dass der Ribosomengehalt pro Zelle auf einem hohen Niveau gehalten wurde. Dies wurde als Stressantwort aller anaeroben Archaeen und Bakterien auf die ungünstigen aeroben Bedingungen interpretiert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden der Verlauf des Fruchtfolgewechsels und dessen Einfluss auf die mikrobielle Gemeinschaft im Boden über einen Zeitraum von zwei weiteren Jahren verfolgt. Nach Einführung der Maiskultivierung in das Reisökosytem erfolgte ein jährlicher Fruchtfolgewechsel mit Reis (geflutet) in der Regenzeit und Mais (nicht geflutet) in der Trockenzeit. Alternativ wurde in beiden Jahreszeiten Reis unter gefluteten Bedingungen angebaut. Die bakterielle Gemeinschaft zeigte eine geringe Reaktion auf den Fruchtfolgewechsel. Eine stärkere Veränderung erfolgte in der archaeellen Gemeinschaft. Ausgehend von einer von methanogenen Archaeen dominierten Gemeinschaft in den gefluteten Reisfeldern entwickelte sich in den nicht gefluteten Maisfeldern eine überwiegend aus aeroben Thaumarchaeoten bestehende Gemeinschaft. Innerhalb der Thaumarchaeoten wurde die Gruppe Soil Crenarchaeotic Group angereichert, welche hauptsächlich von Ammoniumoxidierern (Candidatus Nitrososphaera) repräsentiert wurde. Dies deutet darauf hin, dass der Oxidation von Ammonium möglicherweise eine höhere Bedeutung in nicht gefluteten Boden zukommt. Desweiteren, zeigten auch hier die methanogenen Euryarchaeoten unter nicht gefluteten Feldbedingungen eine Stressreaktion in Form einer erhöhten Ribosomenzahl pro Zelle. Das erneute Fluten in der Regenzeit ermöglichte den Euryarchaeoten allerdings nicht, sich wieder zu erholen und ihre ursprüngliche Abundanz zu erreichen. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen annehmen, dass die Reispflanze Einfluss auf die Mikroben im Reisfeldboden nimmt (erster Teil). Desweiteren führten Veränderungen in den Feldbearbeitungsmaßnahmen, wie Dränage und Fruchtfolgewechsel, zu einer schwachen kurzfristigen Reaktion der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft (zweiter Teil) und einer stärkeren langfristigen Reaktion der methanogenen Archaeen (dritter Teil)

Carbon isotope fractionation during the anaerobic degradation of acetate

Carbon isotope fractionation during the anaerobic degradation of acetate

Charakterisierung der methanotrophen Lebensgemeinschaften in Böden mit geringem Methanangebot und der oligotrophen Adaption

Methan (CH4) ist ein Treibhausgas, dessen Mischungsverhältnis in der Atmosphäre derzeit bei 1,75 ppmv liegt. Im globalen Kreislauf des Methans spielen upland soils als Senke für atmosphärisches Methan eine bedeutende Rolle. Für die Umsetzung von Methan in upland soils sind methanotrophe Bakterien (MB) verantwortlich. Zu Beginn dieser Arbeit beschränkte sich das Wissen über die Zusammensetzung der Gilde der MB in upland soils auf wenige, überwiegend saure Waldböden. Deshalb wurde die Charakterisierung der Gilde der MB auf insgesamt 58 upland soils unterschiedlicher Landnutzung und Bodenart ausgeweitet. Der Nachweis der MB erfolgte kultivierungs-unabhängig, basierend auf die Detektion des pmoA-Gens. In den untersuchten Böden wurden MB der bekannten Gattungen Methylocaldum, Methylobacter, Methylosinus und Methylocystis nachgewiesen. Darüber hinaus wurden pmoA-Gene detektiert, die auf verschiedene Taxa unkultivierter Organismen hinweisen. Weit verbreitet in sauren upland soils sind die Sequenzen des „upland soil cluster a“ (USC a), die auch unter dem Namen „forest sequences“ bekannt sind. Erstmals wurde eine zweite Gruppe von Sequenzen nachgewiesen, die als „upland soil cluster g“ (USC g) bezeichnet wurde. Sequenzen des USC g sind entfernt verwandt zu den Sequenzen methanotropher Gammaproteobakterien und wurden ausschließlich in pH-neutralen Böden (pH > 6) nachgewiesen. Diejenigen MB, die in upland soils hauptverantwortlich für die atmosphärische Methan-Aufnahme sind, wurden in ausgewählten Bodenproben anhand markierter Phospholipid-Fettsäuren (PLFAs) identifiziert, welche nach Inkubation der Proben mit 13CH4 erhalten worden waren. Markierte PLFAs, die charakteristisch für methanotrophe Gammaproteobakterien sind, wurden in Böden detektiert, in denen die methanotrophen Gammaproteobakterien ausschließlich von PmoA-Sequenzen des USC g repräsentiert wurden. Die markierten PLFAs in dem Boden, in dem einzig PmoA-Sequenzen des USC a nachgewiesen worden waren, deuteten auf physiologisch aktive methanotrophe Alphaproteobakterien in dem Boden hin. Somit sind sowohl die Organismen des USC a als auch die des USC g an der atmosphärischen Methanoxidation in verschiedenen Böden beteiligt. Die Methan-Verfügbarkeit im Boden beeinflusst die Zusammensetzung und Aktivität der Gilde der MB. Verschiedene Böden mit unterschiedlicher Ausprägung hydromorpher Merkmale, in denen aufgrund temporärer Flutung zeitweilig Methankonzentrationen oberhalb der atmosphärischen auftreten, belegten, dass die apparenten Km-Werte der Gleyböden mit 100 – 1.100 nM höher waren als die der upland soils und niedriger als die Werte, die für die Methanoxidation an oxisch-anoxischen Grenzflächen methanogener Ökosysteme publiziert sind. Die nachgewiesenen pmoA-Sequenzen deuteten auf eine weite Verbreitung der Gattung Methylocystis und verschiedener unkultivierter potentiell methanotropher Bakterien in den analysierten Böden hin, darunter die Sequenzen des USC a. Der Beitrag der in den Gleyböden vorhandenen MB zur Methanoxidation hing von der Methanverfügbarkeit ab. Während die markierten PLFAs, die nach Inkubation unter Methan-Mischungsverhältnissen von etwa 30 ppmv erhalten worden waren, darauf hinweisen, dass methanotrophe Alphaproteobakterien (Methylocystis spp. und/oder USC a) unter atmosphärischen Bedinungungen aktiv sind, erfolgte unter erhöhten Mischungsverhältnissen (500 ppmv) die Methan-Oxidation auch durch methanotrophe Gammaproteobakterien. Im Rahmen dieser Arbeit wurden MB der Gattungen Methylocystis, Methylosinus und Methylocaldum aus verschiedenen upland soils isoliert und auf ihre Aktivität unter niedrigen Methan-Mischungsverhältnissen (< 1000 ppmv) hin geprüft. Bei Kultivierung in Gegenwart von 10% Methan unterschieden sich die kinetischen Parameter für die Methanoxidation (Vmax(app), Km(app) und a0s) dieser Isolate nicht von denen ausgewählter methanotropher Referenzstämme. Dennoch zeigten die MB Unterschiede hinsichtlich der Aufrechterhaltung ihrer Aktivität in Gegenwart von < 1000 ppmv Methan. Während die meisten methanotrophen Gammaproteobakterien nicht dazu in der Lage waren, ihre Aktivität bei < 1000 ppmv Methan aufrecht zu erhalten, waren mit Ausnahme von Methylocapsa acidiphila alle getesteten methanotrophen Alphaproteobakterien dazu in der Lage. Stämme der Gattung Methylocystis zeigten selbst bei Methan-Mischungsverhältnissen von 1.8 – 10 ppmv noch eine gleichbleibende Methan-Oxidationsaktivität über mehrere Wochen. Die unter atmosphärischen Bedingungen bestimmte Methan-Aufnahmerate von Methylocystis spp. war ausreichend hoch, um die Methan-Aufnahmeraten verschiedener upland soils mit 1,4 – 349 x 106 Zellen pro Gramm trockenen Boden zu erklären. Zusammenfassend lassen die hier präsentierten Ergebnisse den Schluss zu, dass sowohl kultivierte als auch verschiedene unkultivierte MB am Prozess der atmosphärischen Methanoxidation in upland soils beteiligt sein können. In Waldböden und Wiesen, in denen häufig hohe Methan-Aufnahmeraten bestimmt werden, sind die Organismen des USC a und USC g weit verbreitet und an der atmosphärischen Methan-Oxidation beteiligt. In landwirtschaftlich intensiv genutzten Böden, in denen MB bekannter Gattungen nachgewiesen wurden, nicht aber die unkultivierten MB des USC a und USC g, wurden vergleichsweise niedrige Methan-Aufnahmeraten bestimmt. Die für Methylocystis spp. bestimmten atmosphärischen Methan-Oxidationsraten sind ausreichend hoch, um die Raten in solchen Böden zu erklären

Investigation of microbial groups involved in the uptake of atmospheric trace gases in upland soils

Atmospheric trace gases play a leading role in the changes occurring in the atmosphere at present, including climate change. A significant part of atmospheric trace gas fluxes occurs at the interface between atmosphere and upland soils. Unfortunately, the microorganisms in charge of these dynamics are not fully understood. This thesis therefore focuses on the investigation of microbial groups in terrestrial environments, responsible for or proposed to be involved in the uptake of atmospheric trace gases (CH4, CO2, H2), namely the potential atmospheric methane oxidizer upland soil cluster α (USCα), the autotrophic ammonia oxidizing archaea (AOA), and the hydrogen oxidizing streptomycetes. Several methods were tested to investigate the incorporation of labeled substrate and to monitor the expression of their functional marker genes, pmoA for the high-affinity particulate methane monooxygenase of USCα, amoA for the ammonia monooxygenase of AOA, and hydB for the high-affinity [NiFe]-hydrogenase of Streptomyces sp. PCB7. Although the upland soil cluster α (USCα) in forest soils is assumed to represent methanotrophic bacteria adapted to the trace level of atmospheric methane and to play an essential part in the removal of this greenhouse gas from the atmosphere, so far it is unclear whether these microorganisms are able to obtain all their energy and carbon solely from CH4 or use additional carbon compounds. Stable isotope probing was applied to investigate incorporation of labeled CH4 and acetate into nucleic acids of USCα. The results of this study indicate that USCα might only use atmospheric CH4 as an additional energy source or survival strategy, but utilizes additional carbon compounds, such as acetate, for growth suggesting the USCα represents rather facultative than obligate methanotrophs. Furthermore, CARD-FISH of pmoA transcripts visualized USCα in situ for the first time. These findings promote the knowledge and understanding of upland soils as a sink for atmospheric methane and the microorganisms proposed to be responsible for this process. While for a long time autotrophic bacteria were believed to be solely responsible for the process of ammonia oxidation, there is now increasing evidence that also Archaea are involved. But to date it remained elusive whether ammonia oxidizing archaea in soil can assimilate CO2 and to what extent they are functionally active. Stable isotope probing of nucleic acids using 13CO2 showed that ammonia oxidizing archaea were actively involved in microbial ammonia oxidation in an agricultural soil and did fix CO2 autotrophically, presumably via the hydroxypropionate-hydroxybutyrate cycle. CARD-FISH further demonstrated the numerical importance of the archaeal ammonia oxidizers to the overall archaeal community in this environment. These results give novel evidence that the contribution of nitrifying Archaea to ammonia oxidation and CO2 fixation in terrestrial environments might be substantial. Although hydrogen is considered to be one of the most important future energy carriers, little is known about the global biogeochemical cycle of this trace gas. Previous findings indicate that microorganisms rather than free soil enzymes are responsible for the uptake of atmospheric H2 in soils. In this thesis, CARD-FISH analyses demonstrated that streptomyces spores instead of the mycelia expressed the high-affinity H2 uptake activity. This suggests that H2-oxidizing streptomycetes, or actinobacteria in general, are essential for the uptake of atmospheric H2 in upland soils

Microbial redox cycling of iron in Lake Grosse Fuchskuhle

Peatlands constitute >3% of the Earth’s terrestrial area but store approximately one third of global soil organic carbon. Although peatlands act as sinks for atmospheric carbon, they are net emitters of greenhouse gasses, like CH4 and N2O, into the atmosphere. Hence, most of the studies conducted on peatlands focused on methanogenesis and the role of environmental factors influencing this process and very few studies focused on other electron-accepting processes. Recent studies have shown indications that Fe(III) reduction could be playing an important role in the mineralization of organic carbon in mildly acidic peat bogs. However, this process in peatlands has not been well investigated. In the first part of the work the role of Fe(III) reduction and methanogenesis as electron-accepting processes was investigated. Unlike the earlier hypothesis of sequential reduction of electron acceptors according to their redox potentials in sediments, a simultaneous reduction of Fe(III) and methanogenesis was observed in the sediment of Lake Grosse Fuchskuhle. Quantitative comparison of these processes showed that Fe(III) reduction is the dominant organic matter mineralization process compared to methanogenesis during the course of the incubations. After an initial Fe(III) reduction a fluctuating Fe(II) concentration was observed during the course of our incubation indicating a continuous anaerobic Fe(II) oxidation and reduction in this sediment. Following the above results, the second part of the work focused on identifying, enriching and characterizing microorganisms involved in anaerobic nitrate-dependent Fe(II) oxidation. These investigations indicated the chemolithotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing nature of TM3 Actinobacteria and that these organisms could be involved in mediating anaerobic oxidation of Fe(II) in the sediment. Previous culture-independent studies had shown a widespread distribution of these Actinobacteria in natural environments and were hypothesized to be contributing to ecologically important processes; however, the physiological capabilities of these microorganisms remained unknown. To the best of our knowledge this is the first study to show the autotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing nature of TM3 group of uncultured Actinobacteria. The third part of the thesis deals with the role of humic substances in abiotic and microbial Fe(II) oxidation. Despite the fact that Fe(II) is predominantly present in natural environments as chelated to humic substances, the role of humic substances in mediating Fe(II) oxidation has not been elucidated. Our findings indicate that the presence of humic substances could be beneficial for microorganisms oxidizing Fe(II) due to reduced abiotic Fe(II) oxidation and also possibly due to an increased energy yield caused by a lowering of the redox potential of chelated Fe(II) compared to free Fe(II). Estimations of nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing microorganisms from Lake Grosse Fuchskuhle sediment using a cultivation-based approach showed a two-order of magnitude higher number of chemolithotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing microorganisms when including humic substances in the growth medium. The incubations of sediment under chemolithotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing conditions showed the enrichment of microorganisms belonging to the genus Thiomonas. Further characterization of these enrichments provided preliminary evidence of a chemolithotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing capability of these Thiomonas strains. Lastly, Thiomonas arsenivorans strain 3As was tested for chemolithoautotrophic nitrate-dependent Fe(II) oxidation since the presence of all the genes required for mediating this physiological process were identified in the genome. These assays were performed both in the presence and absence of humic substances. A stoichiometric consumption of Fe(II) and nitrate consistent with nitrate-dependent Fe(II) oxidation was observed in the presence of humic substances under autotrophic growth conditions. In contrast, no Fe(II) oxidation either under autotrophic or heterotrophic conditions was observed in the absence of humic substances, indicating the importance of humic substances in mediating nitrate-dependent Fe(II) oxidation. To the best of our knowledge this is the first study to show a chemolithotrophic nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing physiology in a bacterial pure culture. Furthermore, the findings of the study indicate that humic substances are beneficial for microbial Fe(II) oxidation