« Akkermansia muciniphila » : une nouvelle bactérie jouant un rôle clé dans la fonction barrière de l’intestin, l’inflammation et les désordres métaboliques associés à l’obésité ?

INTRODUCTION et OBJECTIFS : L’obésité, l’insulino-résistance et le diabète de type 2 sont caractérisés par une inflammation de faible intensité associée à une augmentation plasmatique d’un composé d’origine bactérienne, le lipopolysaccharide (LPS). Cette augmentation du LPS plasmatique est liée à une augmentation de la perméabilité intestinale. Une modulation du microbiote intestinal à l’aide de prébiotiques améliore la fonction barrière de l’intestin, l’inflammation et les désordres métaboliques. Cependant, aucune bactérie n’a été reliée de façon causale à ces effets bénéfiques. Récemment, nous avons mis en évidence que les prébiotiques augmentaient de façon drastique Akkermansia muciniphila chez des souris génétiquement obèses. Les objectifs de cette étude sont: d’investiguer les effets d’un régime riche en graisses, l’impact des prébiotiques sur Akkermansia muciniphila et d’étudier son implication sur la fonction barrière de l’intestin, l’inflammation et le métabolisme. MATERIELS et METHODES : Les souris ont été traitées par un régime contrôle ou un régime riche en graisses avec ou sans prébiotiques. L’analyse de la flore a été réalisée par qPCR. RESLTATS : Pour la première fois, nous mettons en évidence qu’Akkermansia muciniphila est dramatiquement diminuée sous un régime riche en graisses (diminuée de 83 fois) alors que son abondance est drastiquement augmentée après un traitement aux prébiotiques (augmentée de 294 fois). Cette bactérie est inversement corrélée avec l’expression de différents marqueurs de l’inflammation dans l’intestin (TLR4, IL1 beta), le foie (Myd88, IL1 beta) et le tissu adipeux (CD11c). Nous avons également démontré qu’Akkermansia muciniphila corrèle positivement avec la masse musculaire et négativement avec l’adiposité et le gain de poids. Nous investiguons actuellement l’impact de l’administration d’Akkermansia muciniphila dans différents modèles d’obésité et de diabète de type2. CONCLUSION : Nous proposons qu’Akkermansia muciniphila représente un lien causal avec la fonction barrière de l’intestin, l’inflammation corporelle globale et le métabolisme dans un contexte d’obésité et de diabète de type 2

Rôle de la "nicotinamide nucleotide transhydrogenase" dans la stimulation de la sécrétion d'insuline par le glucose dans les îlots pancréatiques de souris

Introduction: La « nicotinamide nucleotide transhydrogenase » (NNT) contribue à la production de NADPH dans la matrice mitochondriale des cellules eucaryotes. Son inactivation réduit la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, mais les mécanismes impliqués sont controversés. Matériels et méthodes: Les îlots ont été isolés de souris C57BL/6J dépourvues d’activité NNT et de souris C57BL/6N exprimant la NNT sauvage (îlots-J vs. -N). Nous avons mesuré les effets du glucose sur le potentiel de membrane mitochondrial (rhodamine 123) et la concentration de calcium ([Ca2+]c) (fura2-LR) par microspectrofluorimétrie dans des îlots périfusés. Le rapport ATP/ADP, la sécrétion d’insuline et les contenus en insuline/ADN ont été mesurés après incubation. Pour les rapports NADH/NAD et NADPH/NADP, voir le résumé de Carole Muller. Résultats: Les effets du glucose sur le potentiel de membrane mitochondrial, le rapport ATP/ADP et la ([Ca2+]c) étaient semblables dans les îlots-J et N. Le contenu en insuline des îlots (rapporté au contenu en ADN) et la sécrétion d’insuline à 0,5 et 6 mM glucose étaient semblables dans les deux types d’îlots, mais la sécrétion d’insuline entre 10 et 30 mM glucose était 2 à 2,5 fois plus faible dans les îlots-J (sécrétion normalisée sur le contenu en insuline ou ADN). La stimulation de la sécrétion d’insuline par 30 mM potassium + 250 μM diazoxide était aussi 2 à 2,5 fois plus faible dans les îlots-J quelle que soit la concentration de glucose (0,5-3-6-10-20-30 mM), de sorte que l’action amplificatrice du glucose était semblable dans les deux types d’îlots. Conclusion: L’absence de NNT dans les îlots de souris C57BL/6J réduit de deux tiers la sécrétion d’insuline en réponse au glucose sans altérer le potentiel de membrane mitochondriale, le rapport ATP/ADP ni la [Ca2+]c. Le défaut de sécrétion des îlots-J vs. N semble dû à une diminution d’efficacité du Ca2+ sur l’exocytose

Rôle de la « nicotinamide nucleotide transhydrogenase » dans la réduction rapide du glutathion mitochondrial dans les îlots pancréatiques de souris

Introduction: Nous avons récemment montré un lien possible entre réduction rapide du glutathion mitochondrial et augmentation du NAD(P)H par le glucose dans les îlots de rat et humains. La « nicotinamide nucleotide transhydrogenase » (NNT), une des enzymes mitochondriales produisant le NADPH, pourrait être impliquée dans ces effets du glucose. Matériels et méthodes: Nous avons comparé les rapports NADH/NAD et NADPH/NADP, et l’oxydation de GRX1-roGFP2 (une sonde fluorescente ratiométrique sensible à l’oxydation du glutathion) dans la mitochondrie et le cytosol d’îlots de souris C57BL/6J (exprimant une NNT inactive) et C57BL/6N (exprimant la NNT sauvage) (îlots-J vs. -N), à différentes concentrations de glucose. La NNT a été exprimée dans les îlots-J par infection adénovirale. Résultats: Dans les îlots-N, l’oxydation de mt-GRX1-roGFP2 augmentait à 0.5 mM de glucose mais diminuait avec l’augmentation de la concentration de glucose, contrairement aux îlots-J où la sonde restait faiblement oxydée à toutes les concentrations. La sonde cytosolique montrait, elle, dans les îlots-N mais pas –J, une légère oxydation en absence de glucose, diminuée par une concentration de 2-5 mM glucose. Dans les îlots-N, les rapports NADH/NAD et NADPH/NADP étaient augmentés par le glucose et diminués par le FCCP, contrairement aux îlots-J où on observait une réponse identique pour le rapport NADH/NAD mais un rapport NADPH/NADP plus élevé en basal et peu stimulé par le glucose ou inhibé par le FCCP. L’expression de la NNT sauvage dans les îlots-J donnait des résultats comparables aux îlots-N quant aux rapports NADPH/NADP et mt-GRX1-roGFP2. Conclusion: L’absence de NNT dans les îlots de souris C57BL/6J provoque une dissociation entre les changements du ratio NADH/NAD d’une part, et du ratio NADPH/NADP et de l’état d’oxydation du glutathion mitochondrial et cytosolique par le glucose d’autre part. Cette dissociation joue peut-être un rôle dans la diminution de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose des îlots-J vs. N., mais les mécanismes en jeu restent à déterminer

Puissance des effets anti-inflammatoires de l’adiponectine sur le muscle squelettique

Introduction : L’adiponectine, ApN est une adipokine abaissée en cas de syndrome métabolique, ce qui joue un rôle-clef dans la pathogénie de ce syndrome. Nous avons montré que l’ApN exerce d’importants effets anti-inflammatoires sur le muscle squelettique chez des souris soumises à un régime obésogène. Le but de ce travail est de tester la puissance des effets anti-inflammatoires de l’ApN en choisissant un modèle d’inflammation musculaire sévère et soutenue. Matériels et Méthodes : Des souris mdx (atteintes de la myopathie de Duchenne, où l’inflammation joue un rôle aggravant la déficience génétique) ont été croisées avec des souris Tg-ApN (surexprimant l’ApN) afin de générer des souris mdx-Tg-ApN. Des marqueurs d’inflammation / stress oxydatif (TNF-α, IL-1β, NF-κB, CD68, CD3, PRDX3, PRDX5, HNE) ont été étudiés/quantifiés par immunohistochimie, ELISA et Western Blot. Ensuite, des tests fonctionnels ont déterminé la force musculaire des souris. Enfin, l’importance de l’atteinte musculaire a été quantifiée par injection d’Evans Blue Dye (EBD) après un exercice excentrique. Résultats : Comparé aux souris témoins, le muscle des souris mdx présente un marquage important (+ 10 à 15 fois ; p<0,001), pour des facteurs pro-inflammatoires (TNF-α, IL-1β, NF-κB) ou de stress oxydatif (péroxyrédoxines 3/5, 4-hydroxynonénal) ainsi qu’une infiltration majeure de macrophages et de lymphocytes. Ces anomalies sont drastiquement réduites chez les souris mdx-Tg-ApN (– 60 à 75 % vs mdx ; p<0,001). Les souris mdx-Tg-ApN montrent aussi une force musculaire globale accrue (+ 50 % vs mdx ; p<0,01) ainsi qu’une quantité réduite d’EBD dans leurs fibres musculaires (– 50 à 60 % vs mdx ; p<0,001). Conclusion : L’ApN se révèle un très puissant agent anti-inflammatoire sur le muscle en cas d’agression. Ces propriétés anti-inflammatoires majeures sont d’intérêt dans le syndrome métabolique ainsi que dans d’autres maladies où l’inflammation joue un rôle pathogénique initiateur ou aggravateur

Identification d’une altération glucotoxique de la fonction des cellules β pancréatiques unique à l’espèce humaine

Introduction La culture prolongée d’îlots pancréatiques de rongeurs en présence de concentrations élevées de glucose s’accompagne d’une augmentation de l’apoptose des cellules β et d’altérations majeures de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose (SSIG) avec abaissement du seuil de stimulation et diminution de la SSIG maximale. Le but de cette étude était de caractériser les altérations glucotoxiques de la survie et de la fonction des cellules β dans des îlots humains en culture. Matériels et Méthodes Les îlots ont été isolés du pancréas de 14 donneurs non-diabétiques entre 2011 et 2016. Après une à deux semaines de préculture en milieu CMRL et/ou RPMI complet contenant 5mM de glucose et 10% de sérum de veau fœtal, les îlots ont été cultivés 7 jours en RPMI contenant 5, 8 ou 20mM glucose (G5, G8, G20). L’apoptose des cellules β a été mesurée sur coupes d’îlots (TUNEL/insuline double positivité). La fonction des cellules β a été évaluée en mesurant la concentration cytosolique de calcium ([Ca2+]c)(fura2-LR), et la sécrétion d’insuline lors d’une stimulation aiguë par des paliers de glucose (îlots périfusés à 0,5-2-5-10-30mM glucose). La sécrétion et le contenu en insuline ont été mesurés par dosage radio-immunologique et rapportés au contenu en ADN des îlots. Résultats Caractéristiques des donneurs: 11 hommes/3 femmes ; âge 17-74 (médiane 61) ans; indice de masse corporelle 21-33 (médiane 27,7) kg/m². Pendant la culture d'une semaine, la sécrétion était faible en G5 (~20 pg/îlot par heure) et stimulée 25x en G8 et 35x en G20. Après la culture, la proportion de cellules β dans les îlots (~70%), le pourcentage de cellules β apoptotiques (<1%), et le contenu en ADN des îlots (~250ng/îlot) étaient semblables dans les trois groupes, mais le rapport insuline/ADN des îlots était significativement réduit par la culture en G20 (103-72-21 pg insuline/ng ADN après culture en G5-G8-G20, respectivement). Du point de vue fonctionnel, les îlots cultivés en G5 présentaient une augmentation de la [Ca2+]c et de la sécrétion d’insuline en réponse à une stimulation par 10 et 30mM glucose. Après culture en G8, la stimulation survenait déjà au palier de 5mM glucose et la SSIG maximale aux paliers de 10 et 30mM glucose était plus élevée qu’après culture en G5. Après culture en G20, les îlots n’étaient que faiblement stimulés, et ce de façon maximale, à 5 et 10mM glucose, puis étaient inhibés de façon réversible lors d’une stimulation par 30mM glucose. Cette inhibition paradoxale n’est pas observée dans les îlots de rongeurs après culture en conditions glucotoxiques. Conclusions La culture d'îlots humains pendant une semaine à 8 au lieu de 5mM glucose augmente la sensibilité et l’amplitude de la réponse des cellules β au glucose. La culture d'une semaine à 20 mM glucose n’augmente pas l’apoptose des cellules β humaines mais réduit de 80% leur contenu en insuline et conduit à une inhibition paradoxale de la sécrétion d’insuline audessus de 10mM glucose unique à l'espèce humaine. Ces altérations fonctionnelles pourraient jouer un rôle dans l’adaptation puis la décompensation de la sécrétion d’insuline lors de l’intolérance au glucose et au début du diabète de type 2

Akkermansia muciniphila communique avec l’épithélium intestinal pour contrôler le développement de l’obésité et du diabète de type 2

Introduction : Le microbiote intestinal est impliqué dans le développement de l’obésité, de l’insulino-résistance et du diabète de type 2. Nos travaux précédents ont mis en évidence qu’une bactérie découverte récemment et vivant dans le mucus intestinal, Akkermansia muciniphila, était diminuée (100 à 1000 fois) dans des modèles nutritionnel ou génétique d’obésité et de diabète de type 2. Par contre sa présence dans le contenu caecal est normalisée lors d’un traitement à l’aide de prébiotiques. Cette modulation du microbiote intestinal est associée à une diminution de l’inflammation de bas grade et à une amélioration de la sensibilité à l’insuline et à la leptine. Cependant l’impact direct d’Akkermansia muciniphila sur le métabolisme n’a encore jamais été investigué. Matériel et méthode : Akkermansia muciniphila a été administrée quotidiennement par gavage oral chez des souris nourries avec un régime hyperlipidique pendant 4 semaines. Des marqueurs de l’homéostasie glucidique, du métabolisme lipidique et de la fonction barrière de l’intestin ont été investigués. Résultats : Le traitement avec Akkermansia muciniphila améliore les marqueurs d’insulino-sensibilité et corrige l’hyperglycémie à jeun induite par le régime hyperlipidique. Ces effets bénéfiques sont notamment associés à une diminution de la néoglucogénèse hépatique (diminution de l’expression de l’ARNm de la glucose-6-phosphatase). L’administration d’Akkermansia muciniphila empêche la prise de masse grasse et le développement de l’inflammation du tissu adipeux sous régime hyperlipidique, sans affecter la quantité d’énergie ingérée. Akkermansia muciniphila restaure la fonction barrière de l’intestin (disparition de l’endotoxémie métabolique, restauration de la couche de mucus, modification de la production de peptides antimicrobiens). Conclusions : Ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes de régulation du métabolisme par le microbiote intestinal (Akkermansia.muciniphila) et permettent également de mettre en avant l’intérêt du développement d’un traitement utilisant Akkermansia muciniphila pour la prévention ou le traitement de l’obésité et du diabète de type 2