Efecto de parámetros que intervienen en la transformación vía Agrobacterium tumefaciens en la regeneración de Phaseolus vulgaris L. cultivares 'ICA Pijao' y 'BAT 93'

Phaseolus vulgaris is a crop widely used in human consumption. Its production is affected by the incidence of biotic and abiotic factors. Genetic transformationprovides the possibility of reducing these affections, but the low efficiency in vitro regeneration constitutes a limiting factor for the development of protocols forobtaining plants transformed in this species. The aim of this work was to determinethe effect of bacterial suspension concentration, vacuum infiltration time andco-culture on the regeneration of P. vulgaris shoots in 'ICA Pijao' and 'BAT 93' cultivars. Green nodular calli were inoculated with a suspension of A. tumefaciensat a DO600 0.1, 0.2 and 0.3. Three times of infiltration by vacuum were evaluated:1, 2 and 3 min and co-culture period of three and five days. The concentration ofthe bacterial suspension, the vacuum infiltration time and the co-culture periodaffected the regeneration of shoots of P. vulgaris cv. 'ICA Pijao' and 'BAT 93'. The highest percentages of P. vulgaris shoot regeneration were achieved by inoculatingthe calli with a bacterial suspension adjusted at DO600=0.1, without vacuuminfiltration and 3 days in co-culture. The results of this research constitute thefirst contributions to the scientific community in show the effect of vacuuminfiltration on the regeneration of P. vulgaris tissue inoculated with A. tumefaciens. Keywords:co-culture, vacuum infiltration, regeneration, bacterial suspensionPhaseolus vulgaris L. es un cultivo muy empleado en el consumo humano. Su producción se encuentra afectada por la incidencia de factores bióticos y abióticos. La transformación genética brinda la posibilidad de reducir estas afectaciones, pero la baja eficiencia en la regeneración in vitro constituye una limitante para el desarrollo de protocolos para la obtención de plantas transformadas en esta especie. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la concentración de la suspensión bacteriana, el tiempo de infiltración por vacío y de co-cultivo en la regeneración de brotes de P. vulgaris en los cultivares 'ICA Pijao' y 'BAT 93'. Callos nodulares verdes se inocularon con una suspensión de A. tumefaciens ajustada a DO600 de 0.1, 0.2 y 0.3. Se evaluaron tres tiempos de infiltración por vacío: 1, 2 y 3 min y tiempos de co-cultivo de tres y cinco días. La concentración de la suspensión bacteriana, el tiempo de infiltración por vacío y el período de co-cultivo afectan la regeneración de brotes de P. vulgaris cv. 'ICA Pijao' y 'BAT 93'. Los mayores porcentajes de regeneración de brotes de P. vulgaris se lograron al inocular los callos con una suspensión bacteriana ajustada a DO600=0.1, sin infiltración con vacío y 3 días en co-cultivo. Los resultados de esta investigación constituyen los primeros aportes a la comunidad científica en demostrar el efecto de la infiltración por vacío en la regeneración de tejido de P. vulgaris inoculado con A. tumefaciens. Palabras clave: co-cultivo, infiltración por vacío, regeneración, suspensión bacterian

Effect of parameters involved in the transformation via <i>Agrobacterium tumefaciens</i> in the regeneration of <i>Phaseolus vulgaris</i> L. cultivars 'ICA Pijao' and 'BAT 93'

Phaseolus vulgaris is a crop widely used in human consumption. Its production is affected by the incidence of biotic and abiotic factors. Genetic transformation provides the possibility of reducing these affections, but the low efficiency in vitro regeneration constitutes a limiting factor for the development of protocols for obtaining plants transformed in this species. The aim of this work was to determine the effect of bacterial suspension concentration, vacuum infiltration time and co-culture on the regeneration of P. vulgaris shoots in 'ICA Pijao' and 'BAT 93' cultivars. Green nodular calli were inoculated with a suspension of A. tumefaciens at a DO600 0.1, 0.2 and 0.3. Three times of infiltration by vacuum were evaluated: 1, 2 and 3 min and co-culture period of three and five days. The concentration of the bacterial suspension, the vacuum infiltration time and the co-culture period affected the regeneration of shoots of P. vulgaris cv. 'ICA Pijao' and 'BAT 93'. The highest percentages of P. vulgaris shoot regeneration were achieved by inoculating the calli with a bacterial suspension adjusted at DO600=0.1, without vacuum infiltration and 3 days in co-culture. The results of this research constitute the first contributions to the scientific community in show the effect of vacuum infiltration on the regeneration of P. vulgaris tissue inoculated with A. tumefaciens. Keywords:co-culture, vacuum infiltration, regeneration, bacterial suspensio

Regeneración de plantas vía organogénesis directa en Phaseolus vulgaris L.

An efficient and reproducible procedure for plants regeneration from cells and tissue culture is an indispensable requirement for the application of genes transfer methods in plant breeding. Eventhough, the development of tissue culture protocols in some species of plants, genus Phaseolus and especially Phaseolus vulgaris species have remained recalcitrant to in vitro regeneration. A plant regeneration protocol was need for this species. The influence of two cytokinins in the culture medium to induce multiple buds in cv. CIAP 7247 was tested. Besides, the need to place the explants in a pretreatment with liquid medium before subculturing in buds induction culture medium was also evaluated. Several culture media were studied for plant regeneration starting from these structures. Results showed TDZ is indispensable for multiple buds induction in this variety. Significant differences were observed, only in the number of explants with multiple buds, when 0.25 mg.l-1 TDZ were added in the culture medium. Pretreatment with 1 mg.l-1 TDZ to cigotic embryos germinated in vitro was indispensable to increase percentages of multiple buds formation . The 6-BAP did not influence in plant regeneration.Key words: beans, citoquinin, multiple buds, tissue cultureUn procedimiento eficiente y reproducible para la regeneración de plantas a partir de células y cultivo de tejidos es un prerrequisito para la aplicación de métodos de transferencia de genes en el mejoramiento genético de los cultivos. Sin embargo, a pesar del considerable progreso en el desarrollo de protocolos de cultivo de tejidos en numerosas especies de plantas, el género y en especial la especie Phaseolus vulgaris ha permanecido recalcitrante para la regeneración in vitro. Con el objetivo de desarrollar un protocolo de regeneración de plantas en esta especie en el cv. CIAP 7247 se estudió la influencia de dos citoquininas en los medios de cultivo para la inducción de yemas múltiples. Además, se evaluó la necesidad de realizar un pretratamiento a los explantes, en medio de cultivo en estado líquido, antes de subcultivarlos al medio de cultivo para la inducción de yemas múltiples. Se estudiaron varios medios de cultivo para la regeneración de plantas a partir de estas estructuras. Los resultados mostraron que es indispensable el TDZ para la inducción de yemas múltiples en esta variedad. Solo se encontraron diferencias significativas en el número de explantes que formaron yemas múltiples cuando se utilizó una concentración de 0.25 mg.l-1 TDZ en el medio de cultivo. El pretratamiento con TDZ a 1 mg.l-1 a los embriones cigóticos germinados in vitro resultó indispensable para incrementar los porcentajes de formación de yemas múltiples. La adición de 6-BAP no influyó en la regeneración de plantas.Palabras clave: citoquininas, cultivo de tejidos, frijol, yemas múltiple

Efecto del sulfato de adenina en la regeneración y elongación de brotes de frijol común

Plant regeneration and its further development of these are critical steps in tissue culture of Phaseolus vulgaris. The paper shows the effect of adenine sulfate included in the culture media on regeneration and elongation of shoots in the cultivar `CIAP 7247F'. The results showed that adenine sulfate affect plant regeneration and its elongation. The values of regenerated shoots and the plant height were increased. Keywords: in vitro culture, culture medium, Phaseolus vulgaris.La regeneración de brotes, el crecimiento y elongación de las plantas son etapas críticas del cultivo de tejidos en Phaseolus vulgaris. Este trabajo muestra el efecto del sulfato de adenina incluido en los medios de cultivo sobre la regeneración y elongación de brotes en el cultivar `CIAP 7247F'. Los resultados mostraron que el sulfato de adenina influyó tanto en la regeneración de brotes como en la elongación. Se incrementaron los valores del número de brotes regenerados y la altura de la planta cuando fue añadido en los medios de cultivo. Palabras clave: cultivo in vitro, medio de cultivo, Phaseolus vulgaris

Influencia del medio de cultivo en el crecimiento y desarrollo de brotes de Phaseolus vulgaris L. regenerados in vitro

In order touse genetic transformation for plant breeding is indispensable to have protocols of plants regeneration that enable transformed cells to grow, develop and regenerate new plants. Leguminous, in general, have remained recalcitrant to in vitro regeneration; mainly in Phaseolus vulgaris L.specie. The influence of several culture media, proposed in literature for Phaseolus species, and several concentrations of GA3 and AgNO3 in the culture media were studied aimed achieved growth and elongation of shoots regenerated from adventitious buds of this species in the cv. CIAP 7247. Results showed that the presence of GA3 and AgNO3 in the culture medium is indispensable for the elongation of in vitro shoots regenerated from adventitious buds in this variety. The biggest concentrations of this growth regulator enable to obtain shoots elongated tolongitudes oscillating between 0.94 cm to 1.30 cm.Key words: beans, elongation, tissue culturePara utilizar la transformación genética en el mejoramiento de los cultivos es indispensable contar con protocolos de regeneración de plantas que permitan a las células transformadas poder crecer, desarrollarse y regenerar plantas. Las leguminosas en general han permanecido recalcitrantes para la regeneración in vitro sobre todo la especie Phaseolus vulgaris L. Con el objetivo de lograr el crecimiento y elongación de brotes regenerados a partir de yemas adventicias de esta especie en el cv. CIAP 7247 se estudió la influencia de varios medios de cultivo propuestos en la literatura para las especies de Phaseolus, además de varias concentraciones de AG3 y de AgNO3. Los resultados mostraron que es indispensable el AG3 y el AgNO3 en los medios de cultivo para la elongación de brotes regenerados in vitro a partir de yemas múltiples en esta variedad. Las mayores concentraciones de este regulador del crecimiento permitieron obtener brotes elongados con longitudes medias que oscilaron entre 0.94 cm y 1.30 cm.Palabras clave: elongación, cultivo de tejidos, frijo

Influencia del agente gelificante en la regeneración de plantas de Phaseolus vulgaris L. a partir de callos organogénicos

Genotype, type of explant and concentration of growth regulators have been studied to increase efficiency in plant regeneration of Phaseolus vulgaris L. However, studies on the effect of the gelling agent in shoots induction are not enough. Therefore, the present study aimed to determine the effect of gelling agent on organogenic calli proliferation and shoots regeneration of P. vulgaris cv. `BAT-93', `BAT-304', `BAT-482', `Ica Pijao' and `CIAP 7247F'. Callus fresh weight (g) was determined. Number of calli with shoots, number of shoots per callus and number of hyperhydric shoots was measured in shoots regeneration. Results showed that gelling influenced the calli multiplication and shoot regeneration in the five cultivars. `Ica Pijao', `CIAP7247F' and `BAT-93' showed the highest values in calli fresh weight (g) using microbiological agar E. Besides, `BAT-482' reached the highest value of fresh weight of calli in culture medium hardened with gelrite. `BAT-304' calli showed similar values of fresh weight in both treatments. During regeneration, cultivars `BAT-93' and `CIAP 7247F' showed the highest values in the number of callus with shoots and shoots per callus in culture medium solidified with gelrite. Nevertheless, in this treatment there were more hyperhydric shoots regardless the cultivar.  Keywords: agar, in vitro culture, common bean, gelrite.El genotipo, el tipo de explante y la concentración de los reguladores del crecimiento se han estudiado para incrementar la eficiencia en la regeneración de plantas de Phaseolus vulgaris L. Sin embargo, los estudios sobre el efecto del agente gelificante en la inducción de brotes son escasos. Es por ello, que el presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto del agente gelificante sobre la multiplicación de callos organogénicos y la regeneración de brotes de P. vulgaris var. BAT-93, BAT-304, BAT-482, Ica Pijao y CIAP 7247F. Se determinó la masa fresca de los callos (g) y en la regeneración de brotes se cuantificó el número de callos con brotes, el número de brotes por callo y el número de brotes hiperhídricos. Los resultados mostraron que el gelificante influyó en la multiplicación de los callos y regeneración de brotes en las cinco variedades. Se encontró que Ica Pijao, CIAP7247F y BAT-93, mostraron los mayores valores en la masa fresca (g) de los callos cuando se empleó agar microbiológico E. Sin embargo, `BAT-482' alcanzó el mayor valor de masa fresca de los callos en medio de cultivo endurecido con gelrite. Los callos de `BAT-304' presentaron valores de masa fresca similares en los dos tratamientos. En la regeneración las variedades `BAT-93' y `CIAP 7247F' mostraron los mayores valores en el número de callos con brotes y brotes por callo en medio de cultivo solidificado con gelrite. No obstante, en este tratamiento hubo mayor número de brotes hiperhídricos independientemente del cultivar.  Palabra clave: agar, cultivo in vitro, frijol común, gelrite

Formación de embriones somáticos a partir de cotiledones inmaduros en Phaseolus vulgaris cv. CIAP 7247

Common bean, like most of legumes, is recalcitrant to in vitro culture, so the establishment of a regeneration procedure via somatic embryogenesis in this specie has not been possible. Therefore, determining the effect of factors that influencing on somatic embryos formation constitutes an essential step to develop a regeneration protocol via somatic embryogenesis in common bean. Cotyledons of immature seeds were used as initial plant material to achieve the somatic embryos formation in Phaseolus vulgaris cv. CIAP 7247. Five 2,4-D concentrations (10, 20, 30, 40 y 50 mg l-1) and cotyledon orientation on culture medium were studied. After eight weeks on culture, the number of explants that formed somatic embryos and the number of somatic embryos per explant were evaluated. The results demonstrated that the major number of explants that formed somatic embryos and the number of somatic embryos formed per explant were obtained with 40 y 50 mg l-1 of 2,4-D. Somatic embryos were formed on abaxial side from the cotyledons when this side was placed opposite to the culture medium. Somatic embryos on cotyledons from immature seeds of Phaseolus vulgaris L. cv. CIAP 7247 were formed. It was demonstrated that the addition of 2,4-D into culture medium, and the explant orientation had a determining effect on somatic embryogenesis in this important legume.Key words: common bean, regeneration, somatic embryogenesisEl frijol común, como la mayoría de las leguminosas, es difícil de cultivar in vitro, por lo cual el establecimiento de un procedimiento de regeneración de plantas vía embriogénesis somática en esta especie no ha sido posible. Por tanto, determinar el efecto de factores que influyen en la formación de los embriones somáticos constituye un paso esencial para desarrollar un protocolo de regeneración vía embriogénesis somática en el frijol común. Para lograr la formación de embriones somáticos en Phaseolus vulgaris cv. CIAP 7247, se emplearon cotiledones de semillas inmaduras como material vegetal inicial. Se determinó el efecto de cinco concentraciones de 2,4-D (10, 20, 30, 40 y 50 mg l-1) y la orientación de los cotiledones en el medio de cultivo sobre la formación de embriones somáticos. Se evaluaron, a las ocho semanas de cultivo, el número de explantes que formaron embriones somáticos y el número de embriones somáticos por explante. Los resultados demostraron que con 40 y 50 mg l-1 de 2,4-D se presentaron los mayores valores de explantes que formaron embriones somáticos y número de embriones somáticos por explante. Los embriones somáticos se formaron en el lado abaxial de los cotiledones cuando estos fueron colocados con ese lado opuesto al medio de cultivo. Se logró la formación de embriones somáticos en cotiledones de semillas inmaduras de Phaseolus vulgaris L. cv. CIAP 7247. Se demostró que la adición de 2,4-D al medio de cultivo y la orientación del explante sobre el medio de cultivo tuvieron un efecto determinante en la embriogénesis somática de esta importante leguminosa.Palabras clave: embriogénesis somática, frijol común, regeneració