Etude structure-fonction de la cytotoxine VacA d'Helicobacter pylori

Helicobacter pylori est une bactérie à Gram négatif ayant pour unique habitat, l'estomac humain. Ce pathogène qui infecte la moitié de la population mondiale est impliqué dans la genèse des pathologies gastro-duodénales inflammatoires (gastrite chronique, ulcères peptiques, cancers gastriques et lymphome de MALT). H. pylori produit et sécrète une cytotoxine (VacA), dont l'effet le plus visible est de provoquer la formation de vacuoles intracellulaires dans le cytoplasme des cellules épithéliales gastriques. De plus, lorsqu'elle est administrée par voie orale, cette toxine, en se fixant sur le récepteur RPTPb, peut induire des ulcères gastriques chez la souris. VacA est composé de deux domaines (p37 et p58) qui sont séparés par une boucle flexible qui peut être clivée par une protéase. L'activité cytotoxique de VacA est concentrée sur le domaine p37 alors que le domaine p58 est responsable de la liaison de la toxine avec le récepteur cellulaire et de la formation des ulcères gastriques. Avec pour objectif l'élaboration d'un vaccin, nous avons construit plusieurs mutant de H. pylori produisant une toxine VacA détoxifiée. Nous avons démontré qu'une délétion de 8 acides aminés dans le domaine p37 abolie l'activité cytotoxique de la toxine et confère à celle-ci un phénotype dominant négatif. En outre, nous avons montré que la région responsable de la spécificité cellulaire est concentrée sur une région de 148 acides aminés du domaine p58 et que le récepteur RPTPb, n'est pas responsable de cette spécificité cellulaire.Helicobacter pylori is a Gram negative bacterium present in the stomach of approximately one half of the world's population. It is the single most important cause of gastroduodenal disease (chronic gastritis, gastroduodenal ulcer, adenocarcinoma and lymphoma) in humans. H. pylori produce and secrete a vacuolating cytotoxin (VacA) that is capable of inducing vacuoles formation in gastric cells. Moreover, orally administrated VacA induced ulcers in mice. This effect is dependent on the binding of the toxin to the receptor RPTPb. The toxin is structured in two distinct subunits of 37 kDa and 58 kDa (p37 and p58 respectively), which are connected by a hydrophilic loop. The p37 subunit contains the functional vacuolating activity of the toxin whereas the p58 subunit is responsible for binding to cell surface receptors and ulcer formation. With the view to produce a genetically detoxified VacA toxin for use in a vaccine, we constructed several mutants of H. pylori. We showed that a deletion of 8 amino acids in the p37 domain suppress the cytotoxic activity and confer a dominant negative effect. Moreover we found that a region of 148 amino acids delimits the cellular specificity of VacA and that RPTPb is not involved in this cellular specificityAIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF

A Helicobacter pylori Vacuolating Toxin Mutant That Fails To Oligomerize Has a Dominant Negative Phenotype

Most Helicobacter pylori strains secrete a toxin (VacA) that causes massive vacuolization of target cells and which is a major virulence factor of H. pylori. The VacA amino-terminal region is required for the induction of vacuolization. The aim of the present study was a deeper understanding of the critical role of the N-terminal regions that are protected from proteolysis when VacA interacts with artificial membranes. Using a counterselection system, we constructed an H. pylori strain, SPM 326-Δ49-57, that produces a mutant toxin with a deletion of eight amino acids in one of these protected regions. VacA Δ49-57 was correctly secreted by H. pylori but failed to oligomerize and did not have any detectable vacuolating cytotoxic activity. However, the mutant toxin was internalized normally and stained the perinuclear region of HeLa cells. Moreover, the mutant toxin exhibited a dominant negative effect, completely inhibiting the vacuolating activity of wild-type VacA. This loss of activity was correlated with the disappearance of oligomers in electron microscopy. These findings indicate that the deletion in VacA Δ49-57 disrupts the intermolecular interactions required for the oligomerization of the toxin