ESPECTRO DAS MUTAÇÕES NO GENE DA CALRETICULINA NAS NMP: ANÁLISE RETROSPECTIVA

Introdução: As neoplasias Mieloproliferativas (NMP) Philadelphia-negativas, como, Policitemia Vera (PV), Trombocitemia essencial (TE) e Mielofibrose primária (MF), são doenças clonais derivadas da célula progenitora hematopoetica. As mutações direcionadoras de genes como Janus kinase 2 (JAK2) nos éxons (12 e 14), receptor de trombopoetina (MPL/TPOR) e calreticulina (CALR) estão envolvidas diretamente na proliferação clonal e desenvolvimento do fenótipo das NMP. Mutações no último éxon da calreticulina (CALR), o éxon 9, são responsáveis por aproximadamente 25% dos casos de TE e MF. Embora mais de 50 mutações estejam descritas, todas levam ao mesmo framshift no éxon 9 que é responsável pela síntese de uma molécula da CALR. Duas mutações são predominantes: deleção de 52 bp (p.L367fs*46), também chamada de tipo 1 e a inserção de 5 bp (p.K385fs*47) chamada de tipo 2. Na MF, há predominância da mutação tipo 1 enquanto na TE, a frequência é similar dos dois tipos. Outras alterações são classificadas como tipo 1 “like” e tipo 2 “like” com base na estrutura secundária helicoidal ou no número de aminoácidos de ligação. Objetivo: Descrever as diversas mutações identificadas no gene da calreticulina numa análise retrospectiva no período de 2013 a 2023. Métodos: O método consiste na amplificação da região correspondente ao exon 9 do gene da calreticulina, bem como das regiões flanqueadoras a jusante e a montante. O DNA extraído é utilizado para a reação de PCR e em seguida é realizado sequenciamento por STR (Short Tandem Repeat). As mutações identificadas são confrontadas com o banco de dados do Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (Cosmic). Este exame permite identificar mutações que estejam presentes em, pelo menos, 20% dos alelos da amostra. Resultados: Na análise de dados, 2281 casos foram selecionados sendo 1301 do sexo feminino e 980 do sexo masculino. A relação entre F:M foi 1,3:1 e a média de idade foi de 57,9 anos. Em relação ao tipo de amostra para análise da mutação, 248 casos foram amostras de medula óssea e 2033 sangue periférico. A presença da mutação do gene da calreticulina foi identificada em 396 (17,3%) casos com uma variabilidade de 23 subtipos. Os subtipos mais frequentes foram del 52pb (192 casos: 48%) e del 5pb (101 casos:25,5%). Del 5, del 9, del 33, del 45 e del 51 apareceram cada uma, em média, com frequência de 4%. Os subtipos encontrados com apenas um caso descrito foram: del 4pb, del 6pb, del 8pb, del 12pb, del 13pb, del 25pb, del 35pb, del 48pb e del 60pb. As outras alterações somaram 94 casos. Discussão/Conclusão: A presença ou ausência de mutações CALR e seus tipos fornecem informações importantes para o diagnóstico e tomada de decisão terapêutica. O impacto de mutações não habituais no gene da calreticulina deve ser encarado com cautela, uma vez que não há descrição do efeito nas NMP. A ausência de mutações no exon 9 não exclui outras mutações nesse gene, pois a metodologia empregada muitas vezes não identifica outras alterações. Exames por sequenciamento de nova geração podem identificar outras variantes oncogênicas somáticas, portanto, na suspeita de NMP sem mutações direcionadoras habituais, o diagnostico não pode ser excluído

AVALIAÇÃO DA FREQUÊNCIA SOMÁTICA DO GENE IGH E TP53 PRESENTES EM PACIENTES COM LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÔNICA

Introdução: A determinação do estado da Hipermutação Somática (HMS) da região variável da cadeia pesada do gene IGH (IGHV) e a presença de mutações no gene TP53 são marcadores usados para prognóstico e auxílio na decisão terapêutica em pacientes com diagnóstico de Leucemia Linfocítica Crônica (LLC). Objetivos: Foi realizado um estudo retrospectivo entre fev/2021 e jun/2024 da análise do estado mutacional das regiões V-D-J do gene IGHV e mutação somática do gene TP53 em pacientes com LLC, atendidos pelo Grupo Fleury. Materiais e métodos: 1112 amostras de sangue periférico foram coletadas de pacientes com LLC, sendo 55,9% homens e 40,53% mulheres, com mediana de idade de 61 anos. Conforme os critérios previamente descritos pelo E uropean R esearch Initiative on Chronic Lymphocytic Leukemia (ERIC), o RNA obtido a partir de sangue periférico foi processado pela metodologia de sequenciamento de Sanger para análise de IGHV e Sequenciamento de Nova Geração (SNG) para análise da região codificante (éxons 2 ao 11) do gene TP53. Resultados: Das 1112 amostras, não foi possível realizar o teste em 4% devido a fatores como, por exemplo, número reduzido de linfócitos. 81,2% (n = 903) foram considerados como um único rearranjo IGHV, sendo 35,4% (n = 394) mutado, 53,33% (n = 539) não mutado e 4,3% (n = 48) limítrofes. Rearranjos duplos foram observados em 7,6% (n = 84) dos casos (2,7% mutados e 4,9% não mutados) e 2,4% foram classificados como casos sem possibilidade de interpretação (e.g. policlonalidade). Dos rearranjos identificados, 40,2% (n = 440) pertenciam a categoria IGHV3, 14,9% (n = 154) IGHV4, 28% (n = 306) IGHV1-5-7 e 4,8% (n = 52) IGHV2. Foi observado que o rearranjo IGHV1-69 foi mais frequente (14%, n = 153) seguido do IGHV4-34 (7,5%, n = 82) e IGH3-23 (6,1). Para análise da região codificante do gene TP53, não foram identificadas mutações em 86,8% (n = 965) das amostras analisadas, 11,5% (n = 126) apresentaram uma ou mais mutações e apenas 0,2% (n = 2) dos casos foram considerados inconclusivos. Nas amostras com presença de variantes no gene TP53, foi verificado quais categorias de IGHV foram mais frequentes. Dos rearranjos identificados, 41,23% (n = 50) pertenciam a categoria IGHV3, 39,7% (n = 48) IGHV1-5-7, 15,7% (n = 19) IGHV4 e 3,3% (n = 4) IGHV2. Dentre essas categorias, os rearranjos IGHV1-69 (19,8%, n = 24) e IGHV3-23 (7,5%, n = 9) foram observados em maior frequência. Discussão: Das amostras analisadas, apenas 2,4% dos testes para IGHV e 0,2% para TP53 foram inconclusivos. Além disso, a proporção de casos mutados e não mutados do IGHV aqui apresentados corroboram com estudos anteriores, garantindo a confiabilidade dos dados obtidos. Neste estudo, a categoria IGHV1 apareceu em 28% dos testes para IGHV e em 39,7% das amostras com presença de variantes no gene TP53. As categorias IGHV1, IGHV5 e IGHV7 pertencem ao subgrupo #1, que apresenta elevada frequência de mutações no gene TP53. Além disso, o rearranjo IGHV1-69/IGHD3-16/IGHJ3 (subgrupo #6) apresentou a frequência de 1% (n = 12) e não foi identificado nos dados de IGHV de amostras com mutação no gene TP53. A literatura aponta que casos de LLC que são do subgrupo #6 apresentam baixa frequência de mutações no gene TP53. Conclusão: Foi possível verificar que os dados obtidos neste estudo, estão de acordo com outros previamente publicados. O uso das duas abordagens reforça a importância de se usar mais de um marcador prognóstico para fornecer auxílio na decisão clínica e terapêutica