Production of Free Radicals and Oxygen Consumption by Primary Equine Endothelial Cells During Anoxia-Reoxygenation

The endothelium plays an active role in ischemia/reperfusion injuries. Herein, we report the effect of a single or successive cycles of anoxia/reoxygenation (A/R) on the mitochondrial respiratory function of equine endothelial cells (cultured from carotids) monitored by high resolution oxymetry, and on their production of reactive oxygen species (ROS). ROS were measured by electron paramagnetic resonance (ESR) using POBN and DMPO spin traps, and by gas chromatography (GC) of ethylene released by ROS-induced α-keto-γ-(methylthio)butyric acid (KMB) oxidation. The oxygen consumption significantly decreased with the number of A/R cycles, and POBN-ESR spectra were specific of adducts formed in the cells from superoxide anion. After a one-hour A/R cycle, high intensity DMPO-ESR spectra were observed and assigned to superoxide anion trapping; the GC results confirmed an important production of ROS compared to normoxic cells. These results show that A/R induces mitochondrial alterations in endothelial cells, and strongly stimulates their oxidative activity as demonstrated by ESR and GC methods

Free Radical Inhibition Using a Water-Soluble Curcumin Complex, NDS27: Mechanism Study Using EPR, Chemiluminescence, and Docking.

peer reviewedThere is a growing interest in the use of natural compounds to tackle inflammatory diseases and cancers. However, most of them face the bioavailability and solubility challenges to reaching cellular compartments and exert their potential biological effects. Polyphenols belong to that class of molecules, and numerous efforts have been made to improve and overcome these problems. Curcumin is widely studied for its antioxidant and anti-inflammatory properties as well as its use as an anticancer agent. However, its poor solubility and bioavailability are often a source of concern with disappointing or unexpected results in cellular models or in vivo, which limits the clinical use of curcumin as such. Beside nanoparticles and liposomes, cyclodextrins are one of the best candidates to improve the solubility of these molecules. We have used lysine and cyclodextrin to form a water-soluble curcumin complex, named NDS27, in which potential anti-inflammatory effects were demonstrated in cellular and in vivo models. Herein, we investigated for the first time its direct free radicals scavenging activity on DPPH/ABTS assays as well as on hydroxyl, superoxide anion, and peroxyl radical species. The ability of NDS27 to quench singlet oxygen, produced by rose bengal photosensitization, was studied, as was the inhibiting effect on the enzyme-catalyzed oxidation of the co-substrate, luminol analog (L012), using horseradish peroxidase (HRP)/hydrogen peroxide (H(2)O(2)) system. Finally, docking was performed to study the behavior of NDS27 in the active site of the peroxidase enzyme

Effects of Juglone on Neutrophil Degranulation and Myeloperoxidase Activity Related to Equine Laminitis.

Experimental laminitis, characterized by a failure of the dermal-epidermal interface of the foot, can be induced in horses by the oral administration of a black walnut extract (BWE). In the early phase of this severe and painful disease, an activation of neutrophil occurs, with the release of myeloperoxidase (MPO), a pro-oxidant enzyme of neutrophils, in plasma, skin, and laminar tissue. Juglone, a naphthoquinone derivative endowed with redox properties, is found in walnuts and has been incriminated in this neutrophil activation. We report for the first time the inhibitory activity of juglone on the degranulation of neutrophils induced by cytochalasin B and formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine as monitored by the MPO release (>90% inhibition for 25 and 50 μM). Moreover, it also acts on the peroxidase activity of MPO by interacting with the intermediate "π cation radical," as evidenced by the classical and specific immunological extraction followed by enzymatic detection (SIEFED) assays. These results are confirmed by a docking study showing the perfect positioning of juglone in the MPO enzyme active site and its interaction with one of the amino acids (Arg-239) of MPO apoprotein. By chemiluminescence and electron paramagnetic resonance techniques, we demonstrated that juglone inhibited reactive oxygen species (ROS) and superoxide anion free radical produced from phorbol myristate acetate (PMA)-activated polymorphonuclear neutrophils (PMNs). These results indicate that juglone is not the trigger for equine laminitis, at least if we focus on the modulation of neutrophil activation

La fonction mitochondriale des cellules musculaires squelettiques équines en culture : effet de l'anoxie et des neutrophiles activés.

Introduction Les chevaux sont connus pour être de remarquables athlètes. Cependant, réaliser des exercices intenses à répétition, comme le font les chevaux de compétition, peut devenir non seulement une condition stressante menant à des dysfonctions musculaires mais peut également conduire à une diminution de leurs performances. Chez les chevaux, les lésions d'ischémie/reperfusion se retrouvent dans de nombreuses situations cliniques, mais aussi au cours de l'exercice intense, l'oxygénation musculaire diminuant en effet en fonction de l'intensité de l'exercice réalisé. Mais c'est à la réoxygénation suite à l'augmentation du flux d'électron au sein de la chaîne de transport des électrons mitochondriale à l'arrêt de l'effort qu'une importante augmentation de la production d'espèces réactives de l'oxygène et de l'azote (RNOS) va être observée. La réalisation d'exercices intenses est également à l'origine d'une importante réaction inflammatoire systémique. Récemment, des études réalisées par notre groupe sur des chevaux de compétition ont montré que l'exercice intense engendre une stimulation et une dégranulation des polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) avec relargage de myéloperoxydase (MPO) et d'élastase (ELT). L'augmentation de la MPO n'a pas seulement été montrée au niveau plasmatique mais également au niveau musculaire, où elle était associée à une diminution de l'activité du complexe I mitochondrial, démontrant par là, un lien possible entre l'activité de la MPO et les dysfonctions mitochondriales observées chez le cheval à l'exercice. La relation entre les lésions d'ischémie-reperfusion, la production de ROS par la mitochondrie, les dommages musculaires et la réaction inflammatoire chez les chevaux est largement inexplorée. Les principaux objectifs de ce travail visaient à étudier, sur un modèle de culture primaire de cellules musculaires squelettiques, obtenu à partir de microbiopsies, l'effet de l'anoxie/réoxygenation (A/R) et/ou de la MPO sur leur production d'espèces réactives de l'oxygène et leur fonction respiratoire mitochondriale. Résultats Culture primaire de cellules musculaires squelettiques équines à partir de microbiopsies musculaires Avec la microbiopsie musculaire, nous avons mis au point une méthode de prélèvement efficace, réalisable facilement sur le terrain, qui ne provoque aucun désagrément notoire chez le cheval et peut, dès lors, être utilisée même au cours de compétitions sur des chevaux de haut niveau. En utilisant nos microbiopsies comme explants, nous avons pu obtenir une culture primaire de cellules musculaires squelettiques, un modèle expérimental utile pour l'étude in vitro de la fonction musculaire équine. Modèle d'anoxie/réoxygénation des cellules musculaires squelettiques en culture Grâce à cette culture primaire, nous avons montré par fluorescence et chromatographie en phase gazeuse, une production accrue de ROS par les cellules adhérentes soumises à une séquence de 2 h d'A/R. Afin de poursuivre ces investigations, 2 autres modèles d'A/R ont été mis au point sur cellules détachées cette fois: un modèle d'A/R cyclique (2 x 30 min) et un modèle d'une seule longue séquence d'A/R de 1 h, 2 h ou 3 h. Le premier a mis en évidence une diminution de la respiration de routine, mais aussi de la production de ROS et de l'activité spécifique du complexe I mitochondrial des cellules soumises à 2 cycles d'A/R de 30 min. Après une longue période d'A/R au contraire, la respiration de routine, la production de ROS et l'activité spécifique du complexe I mitochondrial des cellules augmentent tandis que la quantité d'ATP produite par ces cellules diminue. Cette observation, en faveur d'un découplage de la phosphorylation oxydative, nous ont poussés à rechercher l'expression de la protéine découplante 3 (UCP3) par les cellules en culture. L'immunofluorescence indirecte ainsi que l'électrophorèse couplée à un western blot a montré qu'elles expriment la protéine UCP3, aussi bien en normoxie qu'après 2 h d'A/R, mais également que son taux d'expression varie en fonction de la durée de l'A/R avec un maximum à 2 h. Le protocole de contrôle de la phosphorylation (PCP) en oxygraphie appliqué ensuite sur les cellules détachées montre que quand les cellules sont soumises à une longue séquence de 2h d'A/R, leur respiration de routine augmente, mais également leur respiration non phosphorylante (après inhibition de l'ATP synthase). Par contre, leur capacité respiratoire maximale diminue de manière importante. En observant les flux control ratios (FCR, rapportés à la capacité respiratoire maximale), nous confirmons que les cellules ayant subi 2 h d'A/R ont besoin de fonctionner plus pour maintenir leur état énergétique stable (augmentation de la part de leur capacité respiratoire maximale utilisée pour la phosphorylation oxydative car diminution de l'efficience). Modèles inflammatoires Activation des neutrophiles équins en sang complet Tous les systèmes d'activations utilisés, le 12-phorbol 13-myristate acetate (PMA), la cytochalasine B couplée au N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (CB/fMLP), le tumor necrosis factor-alpha (TNF- α), le lipopolysaccharide (LPS) et la combinaison LPS/TNF-α, induisaient une dégranulation significative de MPO totale par les PMNs activés en sang complet. En ce qui concerne la MPO active, seules les combinaisons CB/fMLP et LPS/TNF-α en engendrent une libération significative. Enfin, aucune des combinaisons utilisées, mais seulement le PMA seul, ne provoque une dégranulation significative d'ELT par les PMNs. Utilisation de la MPO active équine purifiée Dans un premier temps, nous avons montré que non seulement la MPO mise en contact avec les cellules musculaires squelettiques équines en culture avait la capacité de se lier aux membranes cellulaires, mais en plus, grâce au protocole de centrifugation différentielle, nous avons montré qu'elle était capable de rentrer dans les cellules puisque nous la retrouvons dans la fraction cytosolique. La suite de nos expérimentations nous a montré qu'elle était capable d'augmenter, à elle seule, la production de ROS par les cellules, aussi bien via la méthode de chromatographie en phase gazeuse qu'en fluorescence, et qu'en plus elle fonctionnait bien plus intensément que la horseradish peroxydase (HRP), notre "contrôle peroxydase". La MPO semble aussi altérer la fonction respiratoire mitochondriale des cellules en culture. Ainsi, grâce protocole PCP en oxygraphie, nous avons montré que la MPO seule diminuait principalement leur respiration de routine et leur capacité respiratoire maximale. Paradoxalement, nous avons également remarqué qu'elle augmentait la part de la capacité respiratoire maximale des cellules utilisée pour la respiration de routine et pour la respiration non phosphorylante. Le deuxième protocole d'oxygraphie sur cellules perméabilisées semble confirmer ces observations. Comparées aux cellules contrôles, les cellules incubées avec la MPO présentaient une augmentation de leur respiration non phosphorylante et une diminution de leur capacité respiratoire maximale, en particulier via le complexe I mitochondrial. Modèles combinés: anoxie/réoxygénation en conditions inflammatoires Autant par fluorescence que par chromatographie en phase gazeuse, la MPO amplifiait la production de ROS déjà augmentée par l'A/R. De plus, grâce à la coloration à la 3,3-diaminobenzidine, nous avons mis en évidence la persistance de la MPO (comme de la HRP) dans les cellules musculaires même après 2 h d'A/R. Le protocole PCP en oxygraphie confirme que la MPO semble accentuer les dégâts déjà engendrés par le phénomène d'A/R seul. Ainsi, comparé à ce que nous pouvons observer à la suite de l'A/R seule, l'ajout de MPO cause une encore plus grande diminution de la respiration de routine et de la capacité respiratoire maximale des cellules et augmente leur respiration non phosphorylante. Ces observations, en faveur d'une importante dysfonction mitochondriale, sont confirmées par les FCR. C'est ainsi que nous avons pu montrer que les cellules ayant subi une A/R après avoir été mises en contact avec la MPO ont besoin d'utiliser une plus grande part de leur capacité respiratoire maximale pour la respiration de routine, mais aussi qu'une plus grande part de cette dernière sert visiblement à assurer une respiration non efficace. Ces cellules ont donc besoin de fonctionner plus intensément pour maintenir leur état énergétique, ce qui se reflète dans notre protocole par une augmentation de la part de leur capacité respiratoire maximale utilisée pour la phosphorylation oxydative comparé à ce que nous observons après l'A/R seule. Conclusion et perspectives Au cours de la réalisation d'un exercice intense sont rassemblées, au sein des muscles du cheval de sport, des conditions physiopathologiques induisant d'importantes altérations mitochondriales et donc énergétiques. Au vu de ce que montrent nos travaux, de son implication dans la régulation mitochondriale, aussi bien au niveau respiratoire que de la production de RNOS, et de sa sensibilité particulière aux nitrations, le complexe I mitochondrial pourrait y jouer un rôle clé. Mais bien que nos résultats indiquent clairement que la MPO, en exacerbant les effets délétères de l'A/R, joue un rôle néfaste non seulement au niveau cellulaire mais aussi mitochondrial, des précisions sont encore nécessaires pour confirmer l'implication spécifique du complexe I dans les phénomènes observés. Les résultats in vivo obtenus par notre équipe lors de compétitions ouvrent la voie dans ce sens, mais l'adaptation d'un protocole d'oxygraphie sur cellules perméabilisées, combinant l'A/R et l'action de la MPO, permettrait de confirmer, in vitro, l'hypothèse émise. D'autre part, les effets de nitrations ou de nitrosations sur ce complexe I devront être envisagés plus spécifiquement. Enfin, il serait intéressant, afin d'investiguer d'une manière plus large l'action des PMNs sur la fonction mitochondriale, d'envisager l'utilisation du modèle d'activation en sang complet en co-culture avec les myoblastes équins. L'action d'autres facteurs et médiateurs inflammatoires pourraient ainsi être étudiée dans des conditions vraiment proches de celles qui existent in vivo.Introduction Horses are known to be remarkable athletes. However, to realize such repeated intense exercises, as competition horses do, and could also became a stressing condition leading to muscular dysfunctions but could also decrease their performances. In horses, lesions from ischemia/reperfusion are found in numerous clinical situations but also during intense exercise, the muscular oxygenation decreasing as a function of the exercise intensity. But it is during the reoxygenation, with the subsequent increase of the electron flux within the mitochondrial respiratory electron transport chain at the cessation of exercise, that an important increase of the reactive oxygen and nitrogen species (RNOS) production will be observed. The realization of such intense exercise provokes also an important systemic inflammatory reaction. Recently, some studies realized by our group on competing horses showed that intense exercise can activate the polymorphonuclear neutrophils (PMNs) which degranulate their myeloperoxidase (MPO) and elastase (ELT). The increase of MPO was not only plasmatic but also muscular, where it was associated with a decrease of the mitochondrial complex I activity, showing there a possible link between the MPO activity and the mitochondrial dysfunction in horses performing exercise. The relationship between ischemia/reperfusion, ROS production from mitochondria, muscular damages and inflammatory reaction is largely unexplored in horses. The principal objectives of this work were to study, on a primary culture of equine skeletal muscle cells obtained from muscular microbiopsies, the effect of anoxia/reoxygenation (A/R) and/or of MPO on their ROS production and mitochondrial respiratory function. Results Primary culture of equine skeletal muscle cells from muscular microbiopsies With muscular microbiopsies, we developed an efficient and convenient sampling method, usable in current practice and even on high level competing horses. By using the microbiopsies as explants, we obtained a primary culture of skeletal muscle cells, a suitable experimental model for the in vitro study of equine muscular function. Model of anoxia/reoxygenation applied on cultured equine skeletal muscle cells Thanks to the primary culture, we showed by fluorescence spectroscopy and gas chromatography, an increased ROS production by adherent cells submitted to 2 h of A/R. For the following investigations, 2 other models were designed on detached cells : a first one of cyclic A/R (2 x 30 min) and a second one of a single long period of 1 h, 2 h or 3 h of A/R. The first one showed a decrease of the routine respiration, but also of ROS production and of the mitochondrial complex I specific activity of the cells submitted to cyclic A/R. After a single long period of A/R, on the contrary, the routine respiration, the ROS production and the mitochondrial complex I specific activity of the cells were increased while the ATP production by these cells was decreased. This observation, arguing for an uncoupling of the oxidative phosphorylation, prompted us to investigate the uncoupling protein 3 (UCP3) expression by cultured cells. The indirect immunofluorescence, as well as the electrophoresis coupled with the western blot, showed that they expressed UCP3, in normoxia and after 2 h of A/R, but also that this expression varied as a function of the duration of the A/R, with a maximum observed for 2 h. The oxygraphic phosphorylation control protocol (PCP) applied on detached cells showed an increase of their routine but also of their non phosphorylating (after ATP synthase inhibition) respirations after a single long period of 2 h A/R. Their maximal respiratory capacity, per contra, decreased significantly. When regarding the flux control ratios (FCR, related to maximal respiratory capacity), we confirmed that cells submitted to 2 h of A/R need to function more to keep stable their energetic state (increase of the part of their maximal respiratory capacity used for oxidative phosphorylation because of a lesser efficiency). Inflammatory model Equine neutrophils activation in whole blood All the activation systems used, 12-phorbol 13-myristate acetate (PMA), cytochalasin B with N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (CB/fMLP), tumor necrosis factor-alpha (TNF- α), lipopolysaccharides (LPS) and LPS with TNF-α, induced a significant degranulation of total MPO by the PMNs activated in whole blood. Only the combinations CB/fMLP and LPS/TNF-α caused a significant release of active MPO. For the release of ELT by activated PMNs, only the action of the PMA was significant. Use of purified active equine MPO Initially, we showed that MPO incubated with equine skeletal muscle cells was able to bind to the cell membranes, but furthermore, thanks to the differential centrifugation protocol, that we demonstrated that it was able to enter within the cells, because we found it in the cytosolic fraction. Our following experiences showed that it was able, even alone, to increase the ROS produced by the cells, as demonstrated by fluorescence and gas chromatography. Furthermore, MPO worked harder than Horseradish peroxidase (HRP), our "peroxidasic control". The MPO seemed also to alter the mitochondrial respiratory function of cultured cells. Anyway, thanks to the oxygraphic PCP protocol, we showed that MPO alone decreased mostly their routine respiration and their maximal respiratory capacity. Paradoxically, we seen that it increased the part of the maximal respiratory capacity used for routine and non phosphorylating respirations. The second oxygraphic protocol, designed on permeabilized cells, seems to confirm these observations. Compared to control cells, the MPO-treated cells had a increased non phosphorylating respiration and a decreased maximal respiratory capacity, particularly via the mitochondrial complex I. Combined model: anoxia/reoxygenation in inflammatory conditions With fluorescence spectroscopy as well as with gas chromatography, the MPO amplifies the ROS production already increased with the A/R alone. Furthermore, with a 3,3-diaminobenzidine (DAB) coloration, we showed the persistence of the MPO (and of the HRP), within the cells, even after 2 h of A/R. The oxygraphic PCP protocol confirms that MPO seems to exacerbate the damage initiated by A/R. Thus, compared to what we observed with A/R alone, the addition of MPO causes a further decrease of the routine respiration and the maximal respiratory capacity of the cells and increases their non phosphorylating respiration. These observations, along the lines of an important mitochondrial dysfunction, were confirmed when regarding the FCR. Thus, MPO-treated cells, submitted to A/R need to use a greater part of their maximal respiratory capacity for routine respiration, but a greater part of it was also used for non efficient respiration. So, these cells need to work more intensely to keep stable their energetic state, what is reflected in our protocol by an increased part of the maximal respiratory capacity used for oxidative phosphorylation compared to what we observed after A/R alone. Conclusion and perspectives During intense exercise, some physiopathological conditions, inducing important mitochondrial and energetic alterations, seem to gather within the muscle of sport horses. As showed by our work, because of its implication in the mitochondrial regulation at the respiratory level as well as for RNOS production, and of its particular sensibility to nitration, the mitochondrial complex I could play a pivotal role. Although our results clearly indicate that MPO, by exacerbating the deleterious effects of A/R, is detrimental to cellular and mitochondrial functions, further precisions are needed to confirm the specific implication of mitochondrial complex I in the observed phenomena. The results obtained by our group in vivo on competing horses lead the way in this direction but, the adaptation of the oxygraphic protocol on permeabilized cells, combining A/R with the action of MPO, will help to confirm, in vitro, the hypothesis. On another way, the effect of nitration or nitrosation on the mitochondrial complex I will need to be further investigated. Finally, to consider in a largest way the action of the PMNs on the mitochondrial function, it will be interesting to use the whole blood model of PMNs activation in co-culture with equine skeletal myoblasts. By this way, the action of other inflammatory factors or mediators could be studied in conditions nearly to the ones observed in vivo

Cellules souches mésenchymateuses d'origine musculaire chez les mammifères

publication date: 2015-06-25; filing date: 2014-12-11The present invention provides a new method of obtaining muscle-derived mesenchymal stem cells from microbiopsies of mammalian origin. The invention provides for a minimally invasive methodology yielding high amounts of MSCs that can differentiate into different cell lineages

Mitochondrial function and aerobic capacity assessed by high resolution respirometry in Thoroughbred horses

During the initial stages of training of young Thoroughbred horses, low intensity exercise is employed to increase aerobic capacity. High Resolution Respirometry (HRR) allows the determination of aerobic capacities in small samples of permeabilised muscle fibres. The aim of the study was to measure the mitochondrial function by HRR in Thoroughbred horses, to compare these values to Warmblood horses and to evaluate the effect of a 10-weeks training period. The mitochondrial function was measured by HRR using different substrate-uncoupler protocols (SUIT 1 and 2) in muscle microbiopsies from two groups of untrained horses: 17 Warmblood and 8 Thoroughbred and in the group of 8 Thoroughbred horses before and after a 10-week training period. The SUIT1 protocol employed to compare the two groups of horses showed that in Thoroughbred horses, the mean values for oxygen flux expressed as tissue mass-specific respiration were significantly higher for complex I (CI)Glutamate+Malate, CI + complex II, and maximum electron transport capacities (ETSmax) than the mean values measured in Warmblood horses. The SUIT 1 and SUIT 2 protocols revealed large differences among Thoroughbred horses before and after training. The SUIT 2 protocols showed a significant difference for the complex I activity before and after training but only when the oxygen flux was expressed as percentage of ETSmax. This study shows the interest of HRR in equine sport medicine and exercise physiology, but shows that the technique requires further refinement. Indeed significant differences have been shown between the Thoroughbred and the Warmblood horses highlighting the need to have baseline data for each breed. The Thoroughbred horses had globally a high oxidative phosphorylation capacity with an increase of CI activity induced by an aerobic training program