Applicazione di nuove soluzioni informatiche per la gestione multicentrica della qualità analitica in un laboratorio clinico

Il controllo di qualità (CQ) di un laboratorio clinico è l’insieme delle attività di misura e monitoraggio della qualità analitica, e rappresenta uno strumento essenziale per garantire il valore clinico del dato di laboratorio. L’approccio statistico del CQ permette di tenere sotto controllo fonti di possibile “errore”, come la variabilità biologica e analitica, garantendo così un’analisi di laboratorio precisa ed accurata ed un risultato finale attendibile. Il calcolo del bias, indice di un errore sistematico della prestazione analitica, e del coefficiente di variabilità (CV), indice di errori casuali, costituiscono due operazioni essenziali all’interno di un corretto programma di controllo di qualità al fine di garantire un basso livello di errore totale e raggiungere il traguardo analitico prefissato. La pianificazione e l’implementazione di un programma organizzato di CQ, basato sulla conoscenza delle performance dei sistemi analitici del laboratorio e sulle specifiche di qualità attuali, consentono di “contenere” la variabilità di processo entro i limiti di un errore massimo accettabile. Le gestione della qualità analitica di un laboratorio clinico è effettuata adottando diverse tipologie di programmi di CQ, come il controllo di qualità interno (CQI), la valutazione esterna di qualità (VEQ) e il controllo di qualità interno allargato (CQA). Quest’ultimo costituisce un importante strumento di confronto tra dati di controlli provenienti da laboratori diversi. La gestione multicentrica di un controllo di qualità interno “esteso” a laboratori affiliati, con il contributo di software esperti che permettono un aggiornamento in tempo reale sulla gestione dei propri dati e quelli degli altri laboratori, costituisce il tema centrale di questa tesi. Lo Unity Real Time ® 2.0, prodotto dalla ditta Bio-Rad e descritto in questo lavoro, è un esempio di software avanzato per la gestione del CQ che, oltre a fornire una serie di strumenti per la gestione real time del CQI, consente l’integrazione e l’invio dei dati di controllo a centri di calcolo che elaborano statistiche di confronto, grazie a sistemi di interfacciamento con i programmi per il controllo dei sistemi analitici del laboratorio. Queste nuove soluzioni informatiche costituiscono l’opportunità di creare “laboratori in rete” per la gestione della qualità analitica di più laboratori contemporaneamente e l’eventuale risoluzione di errori in tempo reale. Negli ultimi anni, la razionalizzazione delle aziende sanitarie della Regione Toscana ha imposto un riassetto dell’organizzazione dei laboratori clinici con conseguente accentramento delle analisi in laboratori multicentrici. Le soluzioni di connettività interlaboratorio costituiscono in questo senso il miglior strumento per una gestione omogenea del controllo della qualità analitica dei laboratori sul territorio

Magnetic hyperthermia and oxidative damage to dna of human hepatocarcinoma cells

Nanotechnology is addressing major urgent needs for cancer treatment. We conducted a study to compare the frequency of 3-(2-deoxy-β-d-erythro-pentafuranosyl)pyrimido[1,2-α]purin-10(3H)-one deoxyguanosine (M1dG) and 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxodG) adducts, biomarkers of oxidative stress and/or lipid peroxidation, on human hepatocarcinoma HepG2 cells exposed to increasing levels of Fe3O4-nanoparticles (NPs) versus untreated cells at different lengths of incubations, and in the presence of increasing exposures to an alternating magnetic field (AMF) of 186 kHz using 32P-postlabeling. The levels of oxidative damage tended to increase significantly after ≥24 h of incubations compared to controls. The oxidative DNA damage tended to reach a steady-state after treatment with 60 μg/mL of Fe3O4-NPs. Significant dose–response relationships were observed. A greater adduct production was observed after magnetic hyperthermia, with the highest amounts of oxidative lesions after 40 min exposure to AMF. The effects of magnetic hyperthermia were significantly increased with exposure and incubation times. Most important, the levels of oxidative lesions in AMF exposed NP treated cells were up to 20-fold greater relative to those observed in nonexposed NP treated cells. Generation of oxidative lesions may be a mechanism by which magnetic hyperthermia induces cancer cell death

Chromatographic Detection of 8-Hydroxy-2′-Deoxyguanosine in Leukocytes of Asbestos Exposed Workers for Assessing Past and Recent Carcinogen Exposures

Asbestos fibers include a group of silicate minerals that occur in the environment and are widely employed in occupational settings. Asbestos exposure has been associated to various chronic diseases; such as pulmonary fibrosis; mesothelioma; and lung cancer; often characterized by a long period of latency. Underlying mechanisms that are behind the carcinogenic effect of asbestos have not been fully clarified. Therefore; we have conducted an epidemiological study to evaluate the relationship between 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-oxodG), one of the most reliable biomarkers of oxidative stress and oxidative DNA damage; and asbestos exposure in the peripheral blood of residents in Tuscany and Liguria regions; Italy; stratified by occupational exposure to this carcinogen. Levels of 8-oxodG were expressed such as relative adduct labeling (RAL); the frequency of 8-oxodG per 105 deoxyguanosine was significantly higher among exposed workers with respect to the controls; i.e., 3.0 ± 0.2 Standard Error (SE) in asbestos workers versus a value of 1.3 ± 0.1 (SE) in unexposed controls (p < 0.001). When the relationship with occupational history was investigated; significant higher levels of 8-oxodG were measured in current and former asbestos workers vs. healthy controls; 3.1 ± 0.3 (SE) and 2.9 ± 0.2 (SE), respectively. After stratification for occupational history; a significant 194% excess of adducts was found in workers with 10 or more years of past asbestos exposure (p < 0.001). 8-oxodG can be used for medical surveillance programs of cohorts of workers with past and recent exposures to carcinogens for the identification of subjects requiring a more intense clinical surveillance

Presenza e modulazione di alcune isoforme di citocromo P450 in vari organi di suino sottoposti a dieta iperlipidica

Il sistema citocromo P450 (CYP) è una superfamiglia di enzimi che svolgono un ruolo fisiologico importante nel metabolismo di sostanze endogene ed esogene. Si tratta di enzimi di fase I presenti prevalentemente a livello epatico che si riscontrano, tuttavia, anche in molti tessuti extraepatici. L'espressione e l'attività di alcune isoforme di CYP possono essere indotte, o inibite, da molti xenobiotici, come ad esempio farmaci o inquinanti ambientali. Anche i fattori dietetici, tra cui i lipidi, rivestono un ruolo importante nella modulazione di alcune isoforme di CYP. Le sottofamiglie 4A, 2E e 2C sono le sottofamiglie più strettamente associate al metabolismo degli acidi grassi e alla modulazione da dieta iperlipidica. In questo lavoro di tesi è stato scelto il suino come modello sperimentale in quanto è stato proposto, negli ultimi anni, come modello animale per studi di farmacologia e tossicologia a causa delle sue somiglianze anatomiche e fisiologiche con l’uomo, oltre che per il suo vasto impiego in studi di patologia sperimentale per importanti malattie umane come aterosclerosi ed altre malattie cardiovascolari. Tuttavia, le conoscenze riguardo gli enzimi metabolici del suino sono scarse. É noto, da studi precedenti, che una dieta iperlipidica è in grado di indurre nell’uomo e nei roditori i CYP4A, tramite attivazione del recettore nucleare peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα), e il CYP2E1, e di inibire i CYP2C. Lo scopo principale di questa tesi è stato quello di investigare gli effetti di una dieta iperlipidica sulla modulazione dei CYP4A, CYP2E1 ed alcuni membri della sottofamiglia 2C (CYP2C33, 2C42, 2C49) in fegato, rene e duodeno di suino. Inoltre, è stato valutato l’effetto della dieta iperlipidica sull’espressione di geni coinvolti nel metabolismo del colesterolo, ed in particolare dei CYP7A1 e CYP27A1. Basandosi sulle sequenze geniche, parziali e complete, dei CYP di suino note in banca dati, sono stati disegnati primer specifici per varie isoforme di CYP (CYP4A21 e CYP4A24, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C42, CYP2C49, CYP7A1 e CYP27A1) e per alcuni recettori nucleari (CAR, PXR, PPARα e LXRα). È stato estratto e retrotrascritto l'RNA totale proveniente da diversi tessuti prelevati da cinque suini di controllo e cinque suini alimentati con dieta iperlipidica. Con il cDNA ottenuto sono stati eseguiti esperimenti di amplificazione genica mediante PCR. Essi hanno dimostrato che le isoforme di CYP considerate e i recettori nucleari non sono modulati a livello genico da una dieta iperlipidica. Esperimenti di Western Blotting effettuati utilizzando anticorpi policlonali anti-CYP2E1, anti-CYP2C11 e anti-CYP4A1 di ratto, su campioni di fegato e rene di suino, hanno confermato 
anche a livello proteico la mancanza di modulazione da dieta iperlipidica evidenziata a livello trascrizionale in questi due organi. A livello di attività enzimatica, sono stati eseguiti alcuni saggi enzimatici su microsomi di fegato, rene e duodeno dei suini di controllo e dei suini alimentati con dieta iperlipidica. Il CYP2E1 è stato investigato in microsomi epatici e renali di suino utilizzando le attività marcatrici p-nitrofenolo idrossilasi e anilina idrossilasi. L’attività del CYP4A è stata analizzata, in campioni di fegato e rene, mediante la quantificazione dei metaboliti ω e ω-1 che si formano in seguito alla idrossilazione dell’acido laurico. Le attività tolbutamide idrossilasi e 7-metossi-4-trifluorometilcumarina-O-demetilasi (MFCOD), entrambe marcatrici di alcune isoforme di CYP2C, sono state condotte su microsomi di fegato, rene e duodeno. L’attività enzimatica testosterone idrossilasi, marcatrice di varie isoforme di CYP, ha permesso di investigare l’attività di tali isoforme in campioni epatici e renali tramite la quantificazione di alcuni metaboliti. Infine sono state eseguite le attività enzimatiche etossiresorufina-O-deetilasi (EROD), 7-etossi-4- trifluorometilcumarina-O-deetilasi (EFCOD) e benzilossichinolina debenzilasi (BQD), marcatrici rispettivamente di isoforme appartenenti alle sottofamiglie CYP1A, CYP2B e CYP3A. I risultati ottenuti hanno mostrato un aumento significativo dell’attività p-nitrofenolo in campioni epatici di suini alimentati con dieta iperlipidica; tuttavia tale induzione non è stata riscontrata a livello genico e proteico, probabilmente a causa di meccanismi post-trascrizionali che regolano l’espressione del CYP2E1. La somministrazione della dieta iperlipidica ha inoltre determinato, come riportato per roditori e uomo, una tendenza alla riduzione, in campioni epatici, delle attività tolbutamide idrossilasi e MFCOD, entrambe marcatrici dei CYP2C. Diversamente da quanto visto in ratti con steatosi dieta-indotta, nessuna variazione significativa è stata riscontrata per quanto riguarda l’attività acido laurico idrossilasi. In conclusione, diversamente dai roditori, in cui la somministrazione di una dieta iperlipidica ha determinato una profonda modulazione degli enzimi del drug metabolism, l’effetto riscontrato nel suino è risultato molto più debole. Questa scarsa modulazione potrebbe essere stata causata da molteplici fattori tra cui la durata troppo breve della dieta, la giovane età dei suini o la refrattarietà dei suini stessi agli effetti di una dieta iperlipidica sull’espressione del citocromo P450