Rôles et régulations de Polo et BubR1 sur les cassures double-­‐brin de l'ADN en mitose

The presence of DNA double strand breaks (DSB) during mitosis is challenging for the cell, as it produces fragments of chromosome lacking a centromere. If not processed, this situation can cause genomic instability resulting in improper segregation of the broken fragments into daughter cells. We uncovered a mechanism by which broken chromosomes are faithfully transmitted to daughter cells via the tethering of the two broken chromosome ends. Several proteins including the mitotic kinase BubR1 and Polo are recruited to the breaks and mediate the proper segregation of the broken fragments. However, the mechanism underlying Polo and BubR1 recruitment to DNA breaks is unknown. Moreover, the molecular mechanisms by which Polo and BubR1 mediate the proper segregation of the broken fragments remain to be elucidated. We first investigated the role and regulation of BubR1 on DNA breaks during mitosis. We show that BubR1 requires Bub3 to localize on the broken chromosome fragment and to mediate its proper segregation. We also find that FizzyCdc20, a co--‐factor of the E3 ubiquitin ligase Anaphase--‐Promoting--‐Complex/Cyclosome (APC/C), accumulates on DNA breaks in a BubR1 KEN box--‐dependent manner. A biosensor for APC/C activity demonstrates a BubR1--‐dependent local inhibition of APC/C around the segregating broken chromosome. These results are consistent with a model where Bub3/BubR1 complex on DNA breaks functions to inhibit the APC/C locally via the sequestration of FizzyCdc20, thus preserving key substrates from degradation, which promotes proper transmission of broken chromosomes. In a second study, we investigated the dependency relationship between Polo and BubR1/Bub3/Fizzy on DNA breaks in mitosis. We used a pulsed UV laser to break one chromosome at a define time during mitosis. We immediately follow the recruitment of GFP--‐tagged proteins to laser--‐induced DNA breaks. My study reveals that Polo is promptly recruited to DNA breaks and precedes BubR1, Bub3 and Fizzy. In addition, while BubR1, Bub3 and Fizzy dissociation from the breaks coincide with telophase and the nuclear envelope reformation, Polo remains on the breaks well into interphase. We further show that the appearance of BubR1, Bub3 and Fizzy on DNA breaks is delayed in polo mutant, indicating that Polo is required for the robust and efficient recruitment of BubR1, Bub3 and Fizzy to DNA breaks. Finally, the timely accumulation of Polo, BubR1 and Bub3 to DNA breaks depends on two components of the DNA Damage Response, the MRN complex (Mre11--‐Rad50--‐Nbs1) and ATM (ataxia--‐telangiectasia mutated). This work gives us a better understanding on how Polo and BubR1, Bub3 and FizzyCdc20 are recruited to DNA breaks in mitosis and how they promote broken chromosomes segregation.La présence de cassures double-brin de l'ADN en mitose est problématique pour les cellules, car cette situation produit des fragments de chromosome ne possédant pas de centromères. En l'absence d'un mécanisme permettant leur prise en charge, ces fragments acentriques n'étant pas attachés au fuseau mitotique, pourraient être ségrégés aléatoirement dans les cellules filles, causant de l'instabilité génomique. Nous avons découvert un mécanisme permettant la transmission correcte des fragments acentriques dans les cellules filles via une structure faisant le lien entre les deux fragments cassés. Plusieurs protéines sont recrutées sur les cassures, comme les kinases mitotiques BubR1 et Polo, et favorisent la ségrégation correcte de ces chromosomes cassés. Cependant, les mécanismes permettant le recrutement de BubR1 et Polo sur les cassures d'ADN en mitose sont inconnus. De plus, les mécanismes moléculaires par lesquels BubR1 et Polo favorisent la ségrégation correcte des fragments acentriques restent à être identifiés. La première partie de mon projet a été d'étudier le rôle et la régulation de BubR1 sur les cassures d'ADN pendant la mitose. Nous avons montré que BubR1 requiert Bub3 pour se localiser sur les chromosomes cassés afin de favoriser leur ségrégation correcte. Nous avons également détecté l'accumulation de FizzyCDC20, un cofacteur de l'E3 ubiquitine ligase APC/C (Anaphase-Promoting- Complex/Cyclosome), sur les cassures d'ADN, et son recrutement dépend de son interaction avec la KEN Box de BubR1. De plus, l'utilisation d'un substrat synthétique de l'APC/C nous a permis de démontrer que la dégradation par l'APC/C est inhibée localement autour du chromosome cassé, de manière dépendante de BubR1. Ces résultats suggèrent fortement que le complexe BubR1/Bub3 recrut é sur les cassures d'ADN inhibe localement l'APC/C en séquestrant FizzyCDC20 et empêche ainsi la dégradation de substrats clefs impliqués dans la ségrégation correcte des chromosomes cassés. La seconde partie de mon projet a été d'étudier les relations d'interdépendance entre Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. Nous avons utilisé un laser UV pulsé pour induire des cassures dans un chromosome à un instant précis pendant la mitose, puis nous avons suivi le recrutement de protéines tagguées GFP sur les cassures de chromosome. Cette étude révèle que Polo est rapidement recrutée sur les cassures d'ADN et précède BubR1, Bub3 et Fizzy. De plus, la disparition de BubR1, Bub3 et Fizzy des cassures d'ADN coïncide avec la télophase alors que Polo disparait des cassures pendant l'interphase. Nous avons également montré que le recrutement de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN est retardé dans les mutants polo, indiquant que Polo est requis pour un recrutement efficace de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN. Pour finir, nous avons montré que l'accumulation de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN dépend de deux composants de la réponse aux dommages à l'ADN, le complexe MRN (Mre11-Rad50-Nbs1) et ATM (ataxia-telangiectasia mutated). Ce travail a permis d'avoir une meilleure compréhension sur la dynamique de recrutement de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. De plus, le mécanisme moléculaire par lequel le complexe BubR1/Bub3 agit pour faciliter la ségrégation des chromosomes cassés a pu être en partie élucidé

Roles and regulations of Polo and BubR1 on DNA-­‐ double-­‐strand breaks during mitosis

La présence de cassures double-brin de l'ADN en mitose est problématique pour les cellules, car cette situation produit des fragments de chromosome ne possédant pas de centromères. En l'absence d'un mécanisme permettant leur prise en charge, ces fragments acentriques n'étant pas attachés au fuseau mitotique, pourraient être ségrégés aléatoirement dans les cellules filles, causant de l'instabilité génomique. Nous avons découvert un mécanisme permettant la transmission correcte des fragments acentriques dans les cellules filles via une structure faisant le lien entre les deux fragments cassés. Plusieurs protéines sont recrutées sur les cassures, comme les kinases mitotiques BubR1 et Polo, et favorisent la ségrégation correcte de ces chromosomes cassés. Cependant, les mécanismes permettant le recrutement de BubR1 et Polo sur les cassures d'ADN en mitose sont inconnus. De plus, les mécanismes moléculaires par lesquels BubR1 et Polo favorisent la ségrégation correcte des fragments acentriques restent à être identifiés. La première partie de mon projet a été d'étudier le rôle et la régulation de BubR1 sur les cassures d'ADN pendant la mitose. Nous avons montré que BubR1 requiert Bub3 pour se localiser sur les chromosomes cassés afin de favoriser leur ségrégation correcte. Nous avons également détecté l'accumulation de FizzyCDC20, un cofacteur de l'E3 ubiquitine ligase APC/C (Anaphase-Promoting- Complex/Cyclosome), sur les cassures d'ADN, et son recrutement dépend de son interaction avec la KEN Box de BubR1. De plus, l'utilisation d'un substrat synthétique de l'APC/C nous a permis de démontrer que la dégradation par l'APC/C est inhibée localement autour du chromosome cassé, de manière dépendante de BubR1. Ces résultats suggèrent fortement que le complexe BubR1/Bub3 recrut é sur les cassures d'ADN inhibe localement l'APC/C en séquestrant FizzyCDC20 et empêche ainsi la dégradation de substrats clefs impliqués dans la ségrégation correcte des chromosomes cassés. La seconde partie de mon projet a été d'étudier les relations d'interdépendance entre Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. Nous avons utilisé un laser UV pulsé pour induire des cassures dans un chromosome à un instant précis pendant la mitose, puis nous avons suivi le recrutement de protéines tagguées GFP sur les cassures de chromosome. Cette étude révèle que Polo est rapidement recrutée sur les cassures d'ADN et précède BubR1, Bub3 et Fizzy. De plus, la disparition de BubR1, Bub3 et Fizzy des cassures d'ADN coïncide avec la télophase alors que Polo disparait des cassures pendant l'interphase. Nous avons également montré que le recrutement de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN est retardé dans les mutants polo, indiquant que Polo est requis pour un recrutement efficace de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN. Pour finir, nous avons montré que l'accumulation de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN dépend de deux composants de la réponse aux dommages à l'ADN, le complexe MRN (Mre11-Rad50-Nbs1) et ATM (ataxia-telangiectasia mutated). Ce travail a permis d'avoir une meilleure compréhension sur la dynamique de recrutement de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. De plus, le mécanisme moléculaire par lequel le complexe BubR1/Bub3 agit pour faciliter la ségrégation des chromosomes cassés a pu être en partie élucidé.The presence of DNA double strand breaks (DSB) during mitosis is challenging for the cell, as it produces fragments of chromosome lacking a centromere. If not processed, this situation can cause genomic instability resulting in improper segregation of the broken fragments into daughter cells. We uncovered a mechanism by which broken chromosomes are faithfully transmitted to daughter cells via the tethering of the two broken chromosome ends. Several proteins including the mitotic kinase BubR1 and Polo are recruited to the breaks and mediate the proper segregation of the broken fragments. However, the mechanism underlying Polo and BubR1 recruitment to DNA breaks is unknown. Moreover, the molecular mechanisms by which Polo and BubR1 mediate the proper segregation of the broken fragments remain to be elucidated. We first investigated the role and regulation of BubR1 on DNA breaks during mitosis. We show that BubR1 requires Bub3 to localize on the broken chromosome fragment and to mediate its proper segregation. We also find that FizzyCdc20, a co--‐factor of the E3 ubiquitin ligase Anaphase--‐Promoting--‐Complex/Cyclosome (APC/C), accumulates on DNA breaks in a BubR1 KEN box--‐dependent manner. A biosensor for APC/C activity demonstrates a BubR1--‐dependent local inhibition of APC/C around the segregating broken chromosome. These results are consistent with a model where Bub3/BubR1 complex on DNA breaks functions to inhibit the APC/C locally via the sequestration of FizzyCdc20, thus preserving key substrates from degradation, which promotes proper transmission of broken chromosomes. In a second study, we investigated the dependency relationship between Polo and BubR1/Bub3/Fizzy on DNA breaks in mitosis. We used a pulsed UV laser to break one chromosome at a define time during mitosis. We immediately follow the recruitment of GFP--‐tagged proteins to laser--‐induced DNA breaks. My study reveals that Polo is promptly recruited to DNA breaks and precedes BubR1, Bub3 and Fizzy. In addition, while BubR1, Bub3 and Fizzy dissociation from the breaks coincide with telophase and the nuclear envelope reformation, Polo remains on the breaks well into interphase. We further show that the appearance of BubR1, Bub3 and Fizzy on DNA breaks is delayed in polo mutant, indicating that Polo is required for the robust and efficient recruitment of BubR1, Bub3 and Fizzy to DNA breaks. Finally, the timely accumulation of Polo, BubR1 and Bub3 to DNA breaks depends on two components of the DNA Damage Response, the MRN complex (Mre11--‐Rad50--‐Nbs1) and ATM (ataxia--‐telangiectasia mutated). This work gives us a better understanding on how Polo and BubR1, Bub3 and FizzyCdc20 are recruited to DNA breaks in mitosis and how they promote broken chromosomes segregation

The Mre11-Rad50-Nbs1 complex mediates the robust recruitment of Polo to DNA lesions during mitosis in Drosophila

International audienceThe DNA damage sensor Mre11-Rad50-Nbs1 complex and Polo kinase are recruited to DNA lesions during mitosis. However, their mechanism of recruitment is elusive. Here, using live-cell imaging combined with micro-irradiation of single chromosomes, we analyze the dynamics of Polo and Mre11 at DNA lesions during mitosis in Drosophila. These two proteins display distinct kinetics. Whereas Polo kinetics at double-strand breaks (DSBs) are Cdk1-driven, Mre11 promptly but briefly associates with DSBs regardless of the phase of mitosis and re-associates with DSBs in the proceeding interphase. Mechanistically, Polo kinase activity is required for its own recruitment and that of the mitotic proteins BubR1 and Bub3 to DSBs. Moreover, depletion of Rad50 severely impaired Polo kinetics at mitotic DSBs. Conversely, ectopic tethering of Mre11 to chromatin was sufficient to recruit Polo. Our study highlights a novel pathway that links the DSB sensor Mre11-Rad50-Nbs1 complex and Polo kinase to initiate a prompt, decisive response to the presence of DNA damage during mitosis

Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage

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Bub3–BubR1-dependent sequestration of Cdc20Fizzy at DNA breaks facilitates the correct segregation of broken chromosomes

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