A class of optimal tests for symmetry based on local Edgeworth approximations

The objective of this paper is to provide, for the problem of univariate symmetry (with respect to specified or unspecified location), a concept of optimality, and to construct tests achieving such optimality. This requires embedding symmetry into adequate families of asymmetric (local) alternatives. We construct such families by considering non-Gaussian generalizations of classical first-order Edgeworth expansions indexed by a measure of skewness such that (i) location, scale and skewness play well-separated roles (diagonality of the corresponding information matrices) and (ii) the classical tests based on the Pearson--Fisher coefficient of skewness are optimal in the vicinity of Gaussian densities.Comment: Published in at http://dx.doi.org/10.3150/10-BEJ298 the Bernoulli (http://isi.cbs.nl/bernoulli/) by the International Statistical Institute/Bernoulli Society (http://isi.cbs.nl/BS/bshome.htm

Contribution à l'étude de la myopathie atypique équine : aspects morphologiques et validation d'un test de la fonction mitochondriale.

La myopathie atypique équine, sujet central de cette thèse, est, dans un premier temps, replacée dans le contexte général des myopathies équines à travers une revue de littérature utilisant des critères morphologiques comme fil conducteur. Deux études originales sont ensuite exposées.La première étude est une évaluation anatomo-pathologique, histopathologique et ultrastructurale réalisée à partir de 32 chevaux âgés de 6 mois à 7 ans, morts ou euthanasiés suite à un syndrome ataxique accompagné de myoglobinurie correspondant à une myopathie atypique. L’étude morphologique de la musculature striée a mis en évidence (1) des zones de nécrose au niveau des muscles de posture, des muscles respiratoires et parfois du myocarde, (2) une dégénérescence segmentaire de type Zenker, monophasique et multifocale, affectant préférentiellement les fibres de type I, (3) une activité enzymatique mitochondriale diminuée avec une distribution hétérogène révélée par la coloration NADH tétrazolium réductase, (4) une absence de sels de calcium intracellulaires, (5) une accumulation intracytoplasmique de gouttelettes lipidiques et (6) des modifications ultrastructurales touchant essentiellement les mitochondries. Ces données indiquent que la myopathie atypique équine exhibe la plupart des caractéristiques morphopathologiques des myopathies toxiques au sens le plus large. Pour confirmer l’hypothèse d’une atteinte mitochondriale primaire, une étude fonctionnelle in vivo a paru nécessaire.Le développement et la validation d’une méthode d’analyse quantitative de la fonction mitochondriale à partir d’échantillons sanguins de chevaux ont fait l’objet de la deuxième étude. Le fluorophore lipophile cationique JC-1 a été choisi en raison de sa capacité d’accumulation dans les membranes mitochondriales et de son spectre de fluorescence directement dépendant du potentiel membranaire. Le potentiel de membrane mitochondrial peut donc être optiquement mesuré par le rapport de la fluorescence orange (indiquant la tendance de JC-1 à former des oligomères lorsque le potentiel de membrane mitochondrial est élevé) sur la fluorescence verte (JC-1 sous forme de monomères lorsque le potentiel de membrane mitochondrial est faible). Une procédure d’analyse standardisée par cytométrie en flux de la fonction mitochondriale des cellules mononucléées sanguines équines est exposée et des valeurs de référence de l’activité mitochondriale des lymphocytes de chevaux sains sont présentées. Les valeurs moyennes de fluorescence associées à JC-1 et leurs rapports se sont avérés stables dans le temps chez un même cheval, indépendantes de l’âge et du sexe et très sensibles à une exposition à un dissipateur du potentiel de membrane (CCCP). Enfin, il a été démontré que le délai entre la prise de sang et l’évaluation de la fonction mitochondriale ne pouvait excéder cinq heures. SUMMARYAtypical equine myopathy, the main subject of this thesis, is first positioned in the general topic of equine myopathies, based on a comprehensive literature review of lesions. Two original studies are then successively presented.The first study is a gross, microscopic and ultrastructural pathology description, based on necropsies of 32 horses, 6 months to 7 years old, found dead or euthanatized with a syndrome of ataxia and myoglobinuria compatible with atypical myopathies. Lesions of the striated muscles were typical of that disease, namely: (1) areas of necrosis in postural and respiratory muscles and, for some animals, in myocardium; (2) segmental Zenker degeneration, multifocal and monophasic, affecting predominantly type I fibers; (3) decreased mitochondrial enzymatic activity, with an intracytoplasmic heterogeneous distribution, as shown by NADH tetrazolium reductase staining; (4) absence of intracellular accumulation of calcium salts; (5) cytoplasmic accumulation of lipid droplets, and (6) ultrastructural alterations centered on mitochondria. Our observations suggested that atypical equine myopathy was to be included among toxic myopathies, in a broad sense. In order to confirm the hypothesis of a primary mitochondrial disease, an in vivo functional study was planned.In the second study, a technique of quantitative evaluation of mitochondrial function was developed and validated, using the buffy coat layer of equine blood. The lipophilic cationic JC-1 fluorophore was chosen because of its ability to accumulate in mitochondrial membranes and because of its fluorescence spectrum, directly dependent on the membrane potential. The mitochondrial membrane potential could be optically measured by calculating the ratio between orange fluorescence (indicating the presence of JC-1 oligomers when the membrane potential was elevated) and green fluorescence (indicating the presence of JC-1 monomers when the membrane potential was low). A standardized technique of mitochondrial function by flow cytometry, based on equine mononuclear white blood cells was presented and reference values for equine lymphocytes mitochondrial activity were proposed. Mean fluorescence values associated with JC-1 and their ratios were found to be stable in a given horse, independent from age and sex, and very sensitive to exposure to CCCP, a dissipater of membrane potential. Finally, it was shown that the time period between blood harvesting and mitochondrial function evaluation could not exceed five hours. AVANT-PROPOSDepuis 2000, le service des autopsies de la Faculté de Médecine vétérinaire de Liège est confronté à des cas sporadiques de myopathie équine d’origine inconnue et dont les lésions ne cadrent pas avec les myopathies décrites dans la littérature.L’objectif de cette thèse est de tenter de mieux caractériser ce qui parait, de manière de plus en plus évidente, être une entité nouvelle. Sur le plan clinique, elle se définit par son caractère sporadique et inattendu (« atypique »), par une incidence saisonnière (printemps et automne), par une symptomatologie identifiable : apparition brutale, myoglobinurie, évolution aiguë et par un décours souvent fatal, en moins de 72 heures. A ce jour, les tentatives de traitement et les investigations entreprises n’ont permis ni de cerner l’étiologie de l’affection, ni de la guérir. Quant à sa pathogénie, elle est encore totalement mystérieuse, en particulier le mécanisme pathologique qui altère la fibre musculaire squelettique, cible privilégiée du tableau lésionnel de la maladie. L’imprévisibilité des cas, la rapidité du processus, le caractère sporadique de l’affection, l’impossibilité de la reproduire expérimentalement sont autant de défis auxquels il a fallu faire face. Afin de dégager une base solide pour le diagnostic, en caractérisant mieux les lésions, et de tenter une avancée dans la pathogénie en proposant un mécanisme d’atteinte de la fibre musculaire, une étude anatomo-pathologique à partir des cas disponibles nous a paru être une priorité. Elle nécessitait préalablement, afin d’éclairer nos observations, de reprendre avec l’œil du morphologiste les maladies musculaires décrites classiquement chez le cheval.La revue des myopathies équines connues constitue la partie initiale de ce travail. Ensuite, une première étude présente, à partir des cas examinés, un inventaire des lésions macroscopiques, microscopiques et ultrastructurales observées dans la myopathie atypique. Sur base des résultats morphologiques qui indiquent une parenté lésionnelle entre la myopathie atypique et les myopathies toxiques, l’hypothèse d’une atteinte primitive des mitochondries a été proposée. La deuxième étude est une tentative d’étayer cette hypothèse par la mise au point d’un test d’activité mitochondriale des lymphocytes équins. PREMIERE PARTIE ARTICLE DE SYNTHESEREVUE MORPHOPATHOLOGIQUEDES MYOPATHIES EQUINES Cassart D., Coignoul F., Desmecht D. Département de Morphologie & Pathologie, Secteur Pathologie, Faculté de Médecine vétérinaire, Sart Tilman B43 , Université de Liège________________________________________Correspondance : Dominique Cassart, [email protected] TITRESRevue morphopathologique des myopathies équinesMorphopathologic review of myopathies among equidaeRÉSUMÉL’identification de la cause d’une myopathie est une vraie gageure dans toutes les espèces en raison de la grande diversité des étiologies, des manifestations cliniques et des lésions. Tant aux yeux du clinicien qu’à ceux de l’anatomo-pathologiste, le fil conducteur qui mène au diagnostic causal d’une myopathie particulière exige que soient identifiées des balises sûres permettant d’intégrer un cas individuel ou une série cohérente d’observations successives à une entité médicale particulière. Dans cette revue morphopathologique des myopathies du cheval, plus particulièrement de celles qui atteignent la musculature striée squelettique, l’accent est mis délibérément sur le fil conducteur histopathologique et, plus particulièrement, sur les éléments morphologiques qui permettent de classer les lésions observées dans un groupe d’entités connues. SUMMARYIdentifying the cause of a myopathy is challenging in any species because of the great diversity of etiologies, clinical signs and lesions. Whenever a clinician or a pathologist is concerned, the way to the diagnosis of a myopathy must be paved with indisputable criteria allowing integration of an individual case in a precise medical entity. In this morphopathologic review of equine myopathies, the priority is given to the histopathologist way of using key morphologic clues for accurate categorization of a myopathy. 1. INTRODUCTIONL’identification de la cause d’une myopathie est une vraie gageure dans toutes les espèces en raison de la grande diversité des étiologies, des manifestations cliniques et des lésions. Tant aux yeux du clinicien qu’à ceux de l’anatomo-pathologiste, le fil conducteur qui mène au diagnostic causal d’une myopathie particulière, a fortiori celui qui conduit à la caractérisation d’une entité nouvelle, exige que soient identifiées des balises sûres, permettant d’intégrer un cas individuel ou une série cohérente d’observations successives à une entité particulière. Dans cette revue morphopathologique des myopathies du cheval, plus particulièrement de celles qui atteignent la musculature striée squelettique, l’accent est mis délibérément sur le diagnostic histopathologique et, plus particulièrement, sur les éléments morphologiques qui permettent de classer les lésions observées dans un groupe d’entités connues. En se donnant un tel cadre de réflexion, on distingue (1) les myopathies qui se caractérisent par une modification substantielle de la taille des fibres musculaires, (2) les myopathies qui se caractérisent par une modification évidente de l’aspect des fibres musculaires, (3) les myopathies qui se caractérisent par un infiltrat cellulaire de l’interstitium et (4) les myopathies sans expression morphologique typique. Pour que la revue conserve un caractère pratique, des informations additionnelles concernant le tableau clinique et l’aspect macroscopique du muscle sur le cadavre complètent les descriptions. Certaines entités qui se distinguent par des lésions relevant de plusieurs catégories ont été, pour la clarté du texte, associées à une seule, tout en soulignant la mixité de l’image morphologique.Dans un travail fondé sur la morphologie du muscle squelettique, il a été jugé nécessaire de présenter un rappel de l’histologie normale du muscle et, en raison du lien étroit qui existe, tout particulièrement dans le muscle, entre structure et fonction, d’y associer un rappel fonctionnel.2. HISTOPHYSIOLOGIE DE LA MUSCULATURE STRIEE2.1. Histologie de la fibre musculaire striée de type squelettiqueLes muscles striés squelettiques sont responsables des mouvements volontaires et du maintien de la posture. L’élément fondamental qui les constitue est la cellule - ou fibre - musculaire squelettique, aussi appelée myocyte. Il s’agit d’une cellule plurinucléée, allongée, dont les dimensions peuvent aller jusqu’à 100 microns de diamètre et plusieurs centimètres de longueur. Le sarcolemne enveloppe la cellule ; il est composé de la membrane plasmique, du cell-coat et de la lame basale. Les noyaux multiples sont périphériques, situés dans le cytoplasme, appelé sarcoplasme, adossés à la face interne de la membrane plasmique. Dans le sarcoplasme se trouvent les éléments contractiles qui sont constitués par les myofilaments d’actine et de myosine organisés en faisceaux appelés myofibrilles et disposés longitudinalement. C’est la superposition régulière de ces myofilaments qui est responsable de la striation transversale de la fibre musculaire visible au microscope optique. La contraction musculaire est la conséquence de l’interaction entre les filaments d’actine et de myosine. Entre les myofibrilles, le sarcoplasme contient des organites tels que les mitochondries mais aussi un système d’extensions tubulaires de la membrane plasmique disposé transversalement à l’intérieur de la cellule. Ce système tubulaire, représenté par les tubes T, les citernes et le réticulum sarcoplasmique, présente donc une lumière en continuité avec l’espace extracellulaire. Ce réseau tubulaire permet un contact étroit entre la membrane plasmique et les unités contractiles, ce qui favorise la propagation de l’onde de dépolarisation et le passage du calcium du réticulum sarcoplasmique vers le sarcoplasme et plus particulièrement vers les myofibrilles. Ceci entraîne une contraction synchronisée au sein de la cellule. Le muscle est entouré de tissu conjonctif vasculaire : l’épimysium, d’où partent les travées conjonctives formant le périmysium qui entoure les faisceaux. Chaque fibre est également encerclée par l’endomysium provenant du périmysium (Antoine, 2006).Les fibres musculaires striées squelettiques peuvent être divisées en trois groupes : (1) les cellules (fibres) de type I, (2) les cellules de type intermédiaire (II A) et (3) les cellules de type II (II B). Les fibres de type I sont des fibres lentes à métabolisme oxydatif, riches en myoglobine et en mitochondries et entourées par de nombreux capillaires. Les fibres de type II sont des fibres rapides à métabolisme glycolytique, pâles, pauvres en myoglobine, contenant moins de mitochondries et desservies par moins de capillaires que les fibres de type I de même taille (Van Vleet et Valentine, 2007). Les fibres intermédiaires peuvent utiliser les deux processus pour la production d’énergie (MacEwen et Hulland, 1986).2.2. Physiologie de la contraction musculaireSuite à un stimulus nerveux, il y a libération au niveau de la synapse neuromotrice d’acétylcholine qui se lie et modifie la conformation des récepteurs nicotiniques au niveau de la fibre musculaire. Il en résulte une ouverture des canaux à ions entrainant une dépolarisation membranaire et la génération d’un potentiel d’action. L’entrée de Na+ dans la cellule induit un changement de polarité de la membrane et l’onde de dépolarisation se propage par les tubes T vers les citernes du réticulum sarcoplasmique. Il en résulte une activation des canaux à Ca++ et la libération de Ca++ dans le sarcoplasme. Le calcium se lie à la troponine C, induisant un changement de conformation de la molécule de tropomyosine qui initie la contraction. La relaxation musculaire est liée au recaptage du calcium par le réticulum sarcoplasmique. C’est cette phase de relâchement du muscle qui nécessite un apport énergétique sous forme d’ATP produite par les mitochondries. Ce sont donc spécifiquement le calcium et l’ATP qui régulent la contraction et la relaxation musculaire (Valberg et Hodgson, 2002). Lors de contraction prolongée du muscle, le déficit d’ATP et l’excès de calcium peuvent entraîner une dégénérescence hyaline des fibres musculaires par coagulation des protéines (Guis et al., 2005).3. LES MYOPATHIES EQUINES3.1. Les myopathies qui modifient la taille des fibres musculaires3.1.1. L’atrophie musculaireL’atrophie musculaire se définit morphologiquement comme une diminution du diamètre des fibres musculaires avec déplétion en éléments contractiles (Van Vleet, 1997). Les fibres atrophiées sont anguleuses avec un épaississement du tissu interstitiel endomysial et une prolifération de cellules adipeuses (Van Vleet et Valentine, 2007). Dans les stades avancés d’atrophie, les cellules peuvent être le siège d’une dégénérescence hyaline (Van Vleet, 1997). Les causes d’atrophie musculaire sont variées ; elles servent traditionnellement de base à leur classification.L’atrophie neurogénique, ou atrophie de dénervation, s’observe lorsque l’innervation des fibres musculaires par le nerf moteur est interrompue. Si la dénervation est complète, ce type d’atrophie peut entreprendre toutes les fibres d’un territoire musculaire. Si la dénervation est incomplète, seules certaines fibres sont atteintes, selon une distribution multifocale. Dans ce cas, les fibres voisines sont augmentées de volume par hypertrophie compensatoire. Ce cas de figure est illustré chez le cheval par l’ equine motor neuron disease (EMND), maladie sporadique affectant des chevaux de tous âges et de toutes races (Valberg et Hodgson, 2002). L’EMND est une maladie dont l’incidence augmente avec l’âge ; l’âge moyen d’apparition étant de 16 ans. Elle se caractérise par une dégénérescence des neurones moteurs des cornes ventrales de la moelle épinière. L’étiologie est inconnue mais la maladie s’accompagne systématiquement de taux sériques très bas en vitamine E, ce qui laisserait supposer une cause carentielle (Valentine et al., 1994). Dans l’EMND, ce sont surtout les fibres de type I qui sont atrophiées.L’atrophie de non usage. Elle s’observe dans un territoire musculaire, souvent un membre, lors d’immobilisation prolongée. Elle peut également faire suite à une ténotomie. Ce processus d’atrophie est plus lent que dans l’atrophie neurogénique (Van Vleet, 1997). L’atrophie de non usage se caractérise par une atteinte des deux types de fibres.L’atrophie associée à la cachexie. Il s’agit d’une atrophie visible tant sur l’animal vivant que sur le cadavre. Elle s’observe tout d’abord au niveau des muscles du dos et des cuisses. Au microscope, l’atrophie touche surtout les fibres musculaires de type II. Ce sont les muscles non posturaux qui sont les plus sévèrement atteints (Van Vleet et Valentine, 2007).L’atrophie associée à la maladie de Cushing. Il s’agit d’une atrophie des fibres de type II avec perte de fibres de type IIB et accumulation de graisse périmysiale, endomysiale et intrasarcoplasmique (Aleman et al., 2006).3.1.2. L’ hypertrophie musculaireL’hypertrophie musculaire se définit, morphologiquement, comme une augmentation du diamètre de la fibre en coupe transversale avec un accroissement du nombre de myofibrilles dans les fibres (Van Vleet et Valentine, 2007). Ce processus est physiologique chez les chevaux sportifs bien entrainés mais peut également accompagner un phénomène pathologique dans les cas d’hypertrophie compensatoire (Van Vleet, 1997).3.2. Les myopathies qui modifient l’aspect des fibres musculaires3.2.1. Les lésions musculaires d’origine traumatiqueLes lésions traumatiques ont la double caractéristique d’entreprendre à la fois les fibres musculaires et le tissu interstitiel. Elles sont généralement la conséquence d’agressions extérieures mécaniques telles que, par exemple, les injections intramusculaires (Turner et Trotter, 1984) ou relèvent de causes physiques, comme c’est le cas lors d’exercices violents (Van Vleet, 1997). Les myopathies traumatiques les plus souvent rencontrées chez le cheval sont les suivantes.La rupture/hernie diaphragmatique du poulain. Elle fait suite à une compression abdominale au moment du poulinage. Cette hernie acquise doit être différenciée d’une hernie congénitale.L’élongation, avec ou sans rupture, des muscles tels que ceux de la région lombaire, les fessiers, les adducteurs, les gastrocnémiens, le dentelé ventral, les semi-membraneux et les semi-tendineux. Ces lésions sont la conséquence d’exercices violents ou inadaptés et présentent différents degrés selon la sévérité de la cause initiale : l’élongation, la rupture partielle et la rupture totale du muscle. Au microscope, les lésions traumatiques se caractérisent par des modifications des fibres musculaires et de l’interstitium. Au niveau des myocytes, on observe une perte de continuité des fibres. Dans l’interstitium, la zone lésée présente des hémorragies, de l’œdème et parfois un infiltrat inflammatoire riche en neutrophiles. Lors du passage à l’état chronique, la lésion se cicatrise avec formation de tissu fibreux (Van Vleet, 1997).3.2.2. La myopathie fibrosante (parfois appelée myopathie ossifiante)Cette maladie, souvent décrite chez le Quarter Horse, peut être observée chez n’importe quel cheval effectuant un travail à vive allure avec des changements de direction secs et des arrêts instantanés. Ces mouvements provoquent des traumatismes répétés, particulièrement au niveau des muscles semi-tendineux mais aussi des semi-membraneux, des biceps fémoraux et des muscles graciles et gastrocnémiens (Valberg et Hodgson, 2002 ; MacLeay, 2004). Ces agressions récurrentes entraînent une réaction inflammatoire chronique qui évolue vers la fibrose avec perte de l’élasticité musculaire et adhérences avec les muscles voisins. Dans certains cas, ces lésions fibreuses sont accompagnées d’ossification (Gomez-Villamandos et al., 1995). Une forme congénitale de cette maladie a été décrite chez des poulains de moins d’un an sans antécédent de traumatisme (Valberg et Hodgson, 2002). Les lésions histologiques sont une atrophie sévère des fibres musculaires, des regroupements de fibres d’un même type, une infiltration du tissu interstitiel par du tissu adipeux et une fibrose périmysiale et épimysiale sévèr