El sistema de señalización de la reelina en la homeostasis y en la inflamación del colon

En 1951, Falconer describió por primera vez un tipo de ratones mutantes espontáneos a los que denominó reeler, los cuales presentaban una mutación autosómica recesiva que les provocaba anormalidades arquitectónicas severas en la corteza cerebral. En 1995 se clonó el gen que codifica la Reelina y se descubrió que el ratón “reeler” no expresaba Reelina (D’Arcangelo y cols., 1995). La Reelina es una glicoproteína de la matriz extracelular de gran tamaño (420 KDalton) fundamental para la regulación de la migración y posicionamiento de las neuronas, células de la glía y astrocitos durante el desarrollo embrionario, regulando la laminación de la corteza cerebral, el hipocampo y el cerebelo. En el cerebro adulto participa en el mantenimiento de la conectividad y plasticidad sináptica, responsables del desarrollo cognitivo (ver revisión Folsom y Fatemi, 2013). Para ejercer su acción la Reelina se une a los receptores de membrana VldlR (receptores de lipoproteínas de muy baja densidad), ApoER2 (receptor 2 de la apolipoproteína E), entre otros, e induce la fosforilación de su proteína efectora citosólica Dab1 (Disabled 1). La Reelina se expresa principalmente en el cerebro y en menor cantidad en tejidos adultos periféricos. Nuestro grupo de investigación describió por primera vez la presencia de Reelina en los miofibroblastos de la mucosa del intestino delgado (García-Miranda y cols., 2010), y su función en la regulación de la dinámica cripta-vellosidad (García-Miranda y cols., 2013). Posteriormente otros autores han corroborado la expresión de Reelina en el tejido intestinal (Saaed y cols., 2012; Xiong y cols., 2013). La función de la Reelina en los tejidos periféricos es desconocida, aunque hay datos que parecen indicar que está implicada en el desarrollo de los tejidos y en su reparación tras el daño tisular (Pulido y cols., 2007; Lorenzetto y cols., 2008; Won y cols., 2006; Courtès y cols., 2011; Rebustini y cols., 2012). Enfermedades inflamatorias intestinales Las enfermedades inflamatorias intestinales constituyen un problema sanitario cuya incidencia ha ido incrementándose en los últimos años. Principalmente incluye dos patologías: la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Aunque la etiología de las enfermedades inflamatorias intestinales es desconocida, estudios recientes indican que se debe a la interacción de distintos factores, tales como la susceptibilidad genética, las condiciones ambientales externas, la flora microbiana intestinal y la respuesta inmune (ver revisión Zhang y Li, 2014). Estudios recientes han identificado una gran variedad de genes asociados a las enfermedades inflamatorias intestinales (Jostins y cols., 2012). Durante las dos últimas décadas la mayoría de los estudios sobre la respuesta inmunitaria en las enfermedades inflamatorias intestinales se han centrado en la respuesta inmune adaptativa, sin embargo, las investigaciones más recientes lo hacen en la respuesta inmune innata de la mucosa durante la inflamación aguda o en la primera fase de la inflamación crónica. En este tipo de respuesta desempeña una función fundamental la barrera intestinal que forma el epitelio, el moco que recubre el epitelio, los enterocitos/colonocitos y las células especializadas en la defensa e inflamación como las células de Paneth y los neutrófilos (ver revisión Zhang y Li, 2014). La enfermedad inflamatoria intestinal se caracteriza por una desregulación de la homeostasis epitelial. Las células epiteliales se comunican con las células mesenquimales que las rodean, entre las que se incluyen los miofibroblastos, a través de cascadas de señalización de citoquinas inflamatorias u otras moléculas, y alteraciones en estas vías pueden producir patologías intestinales. Implicación de la Reelina en procesos patológicos y en la regeneración tisular En el hombre existen múltiples enfermedades neurológicas que se han relacionado con el gen de la Reelina o con los componentes de su vía de señalización, como la esquizofrenia, el autismo, el Alzheimer, la lisencefalia, el trastorno bipolar, el desorden depresivo mayor (ver revisión Folsom y Fatemi, 2013) y la epilepsia (Haas y Frotscher, 2010; Dazzo y cols., 2015). En casi todas ellas la expresión de la Reelina se encuentra reducida. También ha sido relacionada con procesos patológicos periféricos, como la enfermedad de Hirschprung, donde la Reelina se encuentra aumentada (Saeed y cols., 2012). La expresión de Reelina también se encuentra alterada en el desarrollo de algunos cánceres. En el cáncer de mama (Stein y cols., 2010), en el gástrico (Dohi y cols., 2010), en el pancreático (Sato y cols., 2006) y en el carcinoma hepatocelular (Okamura y cols., 2011) la Reelina está disminuida, en cambio los niveles aumentan en el cáncer de próstata (Perrone y cols., 2007) y en el retinoblastoma (Seigel y cols., 2007). Wang y cols. (2002) observaron un aumento en la expresión de Cask y Reelina en el cáncer de esófago mientras que Yuan y sus cols. (2012) describieron una disminución de la Reelina por acción del TGFβ1 en este mismo tipo de cáncer. También ha sido relacionada con procesos inflamatorios así, en la artritis reumatoide la Reelina está aumentada (Magnani y cols., 2010) y disminuye en el cerebro de embriones de ratones gestantes cuyas madres han sido sometidas previamente a inflamación cerebral (Harvey y Boksa, 2012). La infección por rotavirus de las células Caco-2 induce un aumento de la expresión del ARNm de Reelina (Cuadras y cols., 2002). Se han observado aumentos en la expresión de la Reelina tras lesión de distintos tejidos, sugiriendo su participación en la reparación/regeneración de los tejidos dañados. Es el caso de lesiones en la córnea y la retina (Pulido y cols., 2007), en la mielina del nervio periférico (Lorenzatto y cols., 2008), tras isquemia y daño cerebral (Won y cols., 2006; Courtès y cols., 2011) y en la regeneración de la glándula submandibular (Rebustini y cols., 2012). OBJETIVOS Nuestro grupo de investigación identificó por primera vez los componentes del sistema de señalización de la Reelina (Reelina, VldlR, ApoER2 y Dab1) en el intestino delgado de rata y ratón y demostró que las proteínas Reelina y Dab1 están implicadas en la dinámica del eje cripta-vellosidad. Otros resultados observados en los ratones reeler (deficientes en Reelina) mostraban: i) alteraciones en la morfología de la mucosa del intestino delgado observándose mayor anchura de las uniones adherentes, lo que podría permitir el acceso de antígenos de la luz intestinal; ii) una disminución en el número de células Paneth, que reduciría la defensa antimicrobiana intestinal; y iii) variaciones en la expresión de genes implicados en la respuesta inmune e inflamación. Todo ello nos hizo pensar que la Reelina podría tener una función en las patologías intestinales. Por lo anteriormente expuesto, el objeto del presente trabajo es estudiar la expresión, función y regulación del sistema de señalización de la Reelina en la mucosa del colon normal e inflamado de ratón, de acuerdo con el siguiente plan de trabajo: 1. Expresión de los genes Reelina, Dab1, VldlR y ApoER2 en la mucosa del colon de ratón, y el efecto de la edad sobre dicha expresión. 2. Localización de las proteínas Reelina, VldlR, ApoER2 y Dab1 en las células de la mucosa del colon de ratón. 3. Análisis de la morfología y homeostasis de la mucosa del colon de ratón en presencia y ausencia de la Reelina. 4. Efecto de la ausencia de la Reelina en la expresión de los genes SOX9, Ciclina D1, Cdx-2, Smad5, Hes-1 y Atoh-1 en el colon de ratón. 5. Efecto del tratamiento con un agente inflamatorio en la expresión de Reelina, Dab1, VldlR y ApoER2. 6. Análisis del grado de inflamación en el colon de ratones control y reeler. 7. Efecto de la inflamación en la expresión de los genes SOX9, Ciclina D1, Cdx-2, Smad5, Hes-1 y Atoh-1 en el colon de ratones control y reeler. 8. Regulación de la expresión de la Reelina en el colon de ratón durante la inflamación. CONCLUSIONES 1. La mucosa del colon de ratón expresa las proteínas Reelina, sus receptores VldlR y ApoER2 y su proteína efectora Dab1. 2. La Reelina desempeña funciones a lo largo del intestino principalmente en edades más tempranas, mientras que la Dab1 realiza funciones más relevantes en el intestino delgado en todas las edades estudiadas. 3. La Reelina en la mucosa del colon sólo se expresa en los miofibroblastos, mientras que el resto de componentes del sistema se expresa en los colonocitos y en los miofibroblastos. 4. La ausencia de Reelina disminuye la profundidad y diámetro de las criptas, el grosor de la capa muscular del colon y el grosor de las microvellosidades, y aumenta la longitud de las microvellosidades y el espacio intercelular de los desmosomas del epitelio del colon. 5. La Reelina regula la dinámica del epitelio del colon activando la proliferación, migración, diferenciación y apoptosis celular. 6. La mutación del gen Reelina disminuyó la expresión de los factores de transcripción SOX9 y Cdx-2, sugiriendo que la Reelina regula los procesos de homeostasis del epitelio del colon a través de estos genes pertenecientes a la vía de señalización Wnt. 7. La inflamación inducida con DSS aumenta la abundancia del ARNm y de la proteína Reelina debido a un aumento de su expresión génica en los miofibroblastos de la mucosa del colon. 8. El aumento en la expresión de Reelina durante la inflamación del colon, se produce principalmente por hipometilación de su promotor, debido, entre otros factores, a la disminución de la expresión de la enzima ADN metiltransferasa 1 (DNMT1). 9. La disminución en la expresión de la ADN metiltransferasa 1, durante la inflamación, puede ser debida a un aumento en la expresión del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) sugiriendo que el efecto antiinflamatorio de esta citoquina podría estar mediado, al menos en parte, por la Reelina. 10. Los ratones reeler son más susceptibles a la inflamación inducida con DSS, lo que sugiere que la Reelina ejerce una acción protectora en la mucosa del colon. 11. En los ratones reeler, el tratamiento con DSS en el colon aumenta la expresión de los genes implicados en la proliferación y migración celular, Ciclina D1 y Smad-5, pertenecientes a las vías de señalización Wnt y BMP, respectivamente, sugiriendo que la Reelina puede participar en el proceso de reparación del tejido dañado

Reelin expression is up-regulated in mice colon in response to acute colitis and provides resistance against colitis

Reelin is an extracellular matrix protein first known for its key role in neuronal migration. Studies in rodent small intestine suggested that reelin protects the organism from intestinal pathology. Here we determined in mice colon, by real time-PCR and immunological assays, the expression of the reelin signalling system; its response to dextran sulphate sodium (DSS) and the response of wild-type and reeler mice to DSS-treatment. DNA methylation was determined by bisulfite modification and sequencing of genomic DNA. In the colon mucosa reelin expression is restricted to the myofibroblasts, whereas both epithelial cells and myofibroblasts express reelin receptors (ApoER2 and VLDLR) and its effector protein Dab1. The muscle layer also expresses reelin. DSS-treatment reduces reelin expression in the muscle but it is activated in the mucosa. Activation of mucosal reelin is greater in magnitude and is delayed until after the activation of the myofibroblasts marker, α-SMA. This indicates that the DSS-induced reelin up-regulation results from changes in the reelin gene expression rather than from myofibroblasts proliferation. DSS-treatment does not modify Sp1 or Tbr1 mRNA abundance, but increases that of TGF-β1 and ApoER2, decreases that of CASK and DNMT1 and it also decreases the reelin promoter methylation. Finally, the reeler mice exhibit higher inflammatory scores than wild-type mice, indicating that the mutation increases the susceptibility to DSS-colitis. In summary, this data are the first to demonstrate that mouse distal colon increases reelin production in response to DSS-colitis via a DNMT1-dependent hypo-methylation of the gene promoter region and that reelin provides protection against colitisEspaña, Junta de Andalucía CTS 588

Reelin protects from colon pathology by maintaining the intestinal barrier integrity and repressing tumorigenic genes

We previously reported that reelin, an extracellular matrix protein first known for its key role in neuronal migration, reduces the susceptibility to dextran sulphate sodium (DSS)-colitis. The aim of the current study was to determine whether reelin protects from colorectal cancer and how reelin defends from colon pathology. In the colon of wild-type and of mice lacking reelin (reeler mice) we have analysed the: i) epithelium cell renewal processes, ii) morphology, iii) Sox9, Cdx2, Smad5, Cyclin D1, IL-6 and IFNγ mRNA abundance in DSS-treated and untreated mice, and iv) development of azoxymethane/DSS-induced colorectal cancer, using histological and real time-PCR methodologies. The reeler mutation increases colitis-associated tumorigenesis, with increased tumours number and size. It also impairs the intestinal barrier because it reduces cell proliferation, migration, differentiation and apoptosis; decreases the number and maturation of goblet cells, and expands the intercellular space of the desmosomes. The intestinal barrier impairment might explain the increased susceptibility to colon pathology exhibited by the reeler mice and is at least mediated by the down-regulation of Sox9 and Cdx2. In response to DSS-colitis, the reeler colon increases the mRNA abundance of IL-6, Smad5 and Cyclin D1 and decreases that of IFNγ, conditions that might result in the increased colitis-associated tumorigenesis found in the reeler mice. In conclusion, the results highlight a role for reelin in maintaining intestinal epithelial cell homeostasis and providing resistance against colon pathology.España, Junta de Andalucía CTS 588

The Synaptojanins in the murine small and large intestine

The expression of the phosphoinositides phosphatases Synaptojanins (Synjs) 1 and 2 has been shown in brain and in some peripheral tissues, but their expression in the intestine has not been reported. Herein we show that the small and large intestine express Synj1 and Synj2. Their mRNA levels, measured by RT-PCR, are not affected by development in the small intestine but in the colon they increase with age. Immunostaining assays reveal that both Synjs localize at the apical domain of the epithelial cells and at the lamina propria at sites also expressing the neuron marker calretinin. Synj2 staining at the lamina propria is fainter than that of Synj1. In colonocytes Synjs are at the apical membrane and cytosolic membrane vesicles. Synj2 is also at the mitochondria. Western blots reveal that the intestinal mucosa expresses at least two Synj1 (170- and 139-kDa) and two Synj2 (160- and 148-kDa) isoforms. The observations suggest that Synj1–170, Synj2–160, and Synj2–148 in colonocytes, might participate in processes that take place mainly at the apical domain of the epithelial cells whereas Synj1–139 in those at the enteric nervous system. Experimental colitis augments the mRNA abundance of both Synjs in colon but only Synj2 mRNA levels are increased in colon tumors. In conclusion, as far as we know, this is the first report showing expression, location and isoforms of Synj1 and Synj2 in the small and large intestine and that they might participate in intestinal pathology.Junta de Andalucía CTS 0588

Reelin Protects against Colon Pathology via p53 and May Be a Biomarker for Colon Cancer Progression

Previous observations made in human and mouse colons suggest that reelin protects the colon from pathology. In this study, we evaluated reelin expression during the transition from either colitis or precancerous lesions to colon cancer and tried to elucidate reelin regulation under these transition processes. Samples of healthy and pathological colons from humans and mice treated with either azoxymethane/dextran sulfate sodium (DSS) or azoxymethane alone were used. The relative abundances of reelin, DNMT-1 and ApoER2 mRNAs were determined by PCR in the colon samples cited above and in the tissue adjacent to mouse colon polyps and adenocarcinomas. In both, humans and mice, reelin mRNA abundance increased significantly in ulcerative colitis and slightly in polyps and decreased in adenomas and adenocarcinomas. Reelin expression was higher in the tissue adjacent to the colon adenocarcinoma and lower in the lesion itself. The reelin expression changes may result, at least in part, from those in DNMT-1 and appear to be independent of ApoER2. Lack of reelin downregulated p-Akt and p53 in healthy colon and prevented their increases in the inflamed colon, whereas it increased GSK-3β in DSS-untreated mice. In conclusion, reelin mRNA abundance depends on the severity of the colon pathology, and its upregulation in response to initial injuries might prevent the beginning of colon cancer, whereas reelin repression favors it. Increased p53 expression and activation may be involved in this protection. We also propose that changes in colon reelin abundance could be used to predict colon pathology progression.Junta de Andalucía CTS 5884, 2021/1123 BIO-14

Partial restoration of gut-mucosal dysbiosis in late-treated HIV-infected subjects with CD4 T-cell recovery

Fondo de Investigacion Sanitaria PI18/01216, PI21/00357Consejeria de Economia, Innovacion, Ciencia y Empleo CTS2593Instituto de Salud Carlos III CM19/00051, CD19/00143, FI19/00298Junta de Andalucía DOC_01646Consejería de Salud y Familias C-0013-201