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Regulation of glutamine synthetase activity in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by the nitrogen source: Effect of ammonium
Glutamine synthetase activity from Synechocystis sp. strain PCC 6803 is regulated as a function of the nitrogen source available in the medium. Addition of 0.25 mM NH4Cl to nitrate-grown cells promotes a clear short-term inactivation of glutamine synthetase, whose enzyme activity decreases to 5 to 10% of the initial value in 25 min. The intracellular levels of glutamine, determined under various conditions, taken together with the results obtained with azaserine (an inhibitor of transamidases), rule out the possibility that glutamine per se is responsible for glutamine synthetase inactivation. Nitrogen starvation attenuates the ammonium-mediated glutamine synthetase inactivation, indicating that glutamine synthetase regulation is modulated through the internal balance between carbon-nitrogen compounds and carbon compounds. The parallelism observed between the glutamine synthetase activity and the internal concentration of 伪-ketoglutarate suggests that this metabolite could play a role as a positive effector of glutamine synthetase activity in Synechocystis sp. Despite the similarities of this physiological system to that described for enterobacteria, the lack of in vivo 32P labeling of glutamine synthetase during the inactivation process excludes the existence of an adenylylation-deadenylylation system in this cyanobacterium.Direcci贸n General de Investigaci贸n Cient铆fica y T茅cnica PB 88-002
Purification and Properties of Glutamine Synthetases from the Cyanobacteria Synechocystis sp. Strain PCC 6803 and Calothrix sp. Strain PCC 7601
Glutamine synthetases (GSs) from two cyanobacteria, one unicellular (Synechocystis sp. strain PCC 6803) and the other filamentous (Calothrix sp. strain PCC 7601 [Fremyella diplosiphon]), were purified to homogeneity. The biosynthetic activities of both enzymes were strongly inhibited by ADP, indicating that the energy charge of the cell might regulate the GS activity. Both cyanobacteria exhibited an ammonium-mediated repression of GS synthesis. In addition, the Synechocystis sp. showed an inactivation of GS promoted by ammonium that had not been demonstrated previously in cyanobacteria.Comisi贸n Asesora de Investigaci贸n Cient铆fica y T茅cnica 45/85 85-047
Purificaci贸n y propiedades de la ferredoxina-nitrato reductasa de la cianobacteria "Anacystis nidulans"
El nitr贸geno es uno de los elementos cualitativa y cuantitativamente m谩s importantes de la materia viva, en la que se encuentra como componente de algunas de las biomol茅culas m谩s representativas, tales como prote铆nas y 谩cidos nucl茅icos. La v铆a de entrada del nitr贸geno en los seres vivos es el Reino Vegetal, a trav茅s del cual llega a los animales en el estado de m谩xima reducci贸n correspondiente al nitr贸geno org谩nico. Tambi茅n las plantas necesitan que el nitr贸geno est茅 reducido al m谩ximo para poder combinarlos con compuestos carbonados y formar as铆 los distintos compuestos nitrogenados de sus c茅lulas. Sin embargo, a diferencia de los animales, las plantas tienen la capacidad de utilizar el nitr贸geno inorg谩nico existente en la Naturales, el cual reducen hasta amonio previamente a su incorporaci贸n.
Con excepci贸n de un peque帽o grupo de organismos capaces de fijar el nitr贸geno atmosf茅rico, la forma nitrogenada m谩s utilizada es el nitrato, de los que da ide el hecho de que se reduzcan anualmente unos 10.000 millones de toneladas de este compuesto (Beevers y Hageman, 1969; Losada, 1972).
La utilizaci贸n de nitrato como fuente nitrogenada no est谩 restringida a ning煤n grupo de organismos, sino que es general, siendo realizada tanto por algas y plantas superiores, como por distintos g茅neros de hongos y bacterias.
La diferencia existente entre los estados de reducci贸n que presenta el nitr贸geno en el nitrato, +5, y en el amonio, -3, implica la necesidad de una transferencia de 8 electrones que, como ha quedado firmemente establecido, ocurre en s贸lo dos etapas: a) reducci贸n de nitrato a nitrito, catalizada por el enzima nitrato reductasa, y b) reducci贸n de nitrito a amonio, mediada por la nitrito reductasa, en reacciones que implican 2 y 6 electrones respectivamente (Beevers y Hageman, 1969, 1972; Hewitt, 1975; Hewitt et al., 1976; Losada, 1976; Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979).
La reducci贸n de nitrato a nitrito est谩 catalizada por una molibdoprote铆na, la nitrato reductasa, que ha sido estudiada exhaustivamente en los 煤ltimos a帽os. El enzima de organismos eucari贸ticos se ha clasificado como NAD(P)H-nitrato reductasa, atendiendo a la naturaleza de su donador fisiol贸gico de electrones, los pirid铆n nucle贸tidos reducidos. La nitrato reductasa de eucariotas fotosint茅ticos muestra una preferencia por NADH como donador de electrones, habiendo sido purificado a homogeneidad recientemente en el alga verde Chlorella vulgaris. En la NADH-nitrato reductasa de este alga se ha determinado la existencia de tres subunidades de 95-100 KD como constituyentes de un enzima de 356 KD de peso molecular, que contiene como grupos prost茅ticos 2 mol茅culas de FAD, dos grupos hemo del tipo b, y 2 谩tomos de molibdeno (Solomonson et al., 1975). La situaci贸n en hongos, es similar, a excepci贸n de la preferencia del enzima por NADPH, encontr谩ndose tambi茅n FAD, hemo b, y molibdeno en la mol茅cula, si bien son solo dos las subunidades presentes (115 KD cada una) siendo, consecuentemente, su peso molecular (230 KD) inferior al de eucariotas fotosint茅ticos (Garret y Nason, 1969; Pan y Nason, 1979).
En eucariotas, la transferencia de los electrones al nitrato est谩 mediada por dos actividades enzim谩ticas que operan secuencialmente y que, aunque no se han logrado separar f铆sicamente, pueden ser ensayadas independientemente y se afectan de forma espec铆fica por distintos inhibidores y tratamientos. La primera de estas actividades es una NAD(P)H-diaforsa, que contiene FAD y que por ser la captadora de electrones es la que marca la especificidad por NADH 贸 NADPH en cada caso. La segunda actividad del complejo enzim谩tico NAD(P)H-nitrato reductasa es la nitrato reductasa terminal, tambi茅n denominada FNH2-nitrato reductasa, por su capacidad de utilizar flav铆n-nucle贸tidos (o viol贸genos) reducidos, como donadores de electrones. Estudios fisicoqu铆micos y enzim谩ticos de diversa 铆ndole han determinado que el molibdeno est谩 implicado en esta segunda actividad, pens谩ndose que este metal interacciona directamente con el nitrato. El papel de los grupos hemo, as铆 como su participaci贸n en una u otra actividad, permanece a煤n si aclarar definitivamente (Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979).
A diferencia de lo que ocurre con la nitrato reductasa de eucariotas, que se considera soluble, en organismos procari贸ticos el enzima se encuentra, en general, unido a membranas de tipo fotosint茅tico o respiratorio. En estos organismos parece no existir una actividad diafor谩sica similar a la del enzima de eucariotas, encontr谩ndose que los pirid铆n nucle贸tidos reducidos no se comportan como donadores de electrones adecuados para estos enzimas, si bien se han descrito casos en los que se observaba reducci贸n de nitrato con NADH en preparaciones de membranas de bacterias fotosint茅ticas y cianobacterias (Hattori y Myers, 1967; Hattori, 1970; Katoh, 1963).
La ferredoxina, una prote铆na sulfof茅rrica de potencias muy negativo, es el principal candidato para desempe帽ar el papel de donador de electrones fisiol贸gico de la nitrato reductasa de procariotas, habiendo sido descrita su participaci贸n en la reducci贸n de nitrato en algunos organismos tanto fotoerg贸nicos como quimioerg贸nicos. En procariotas fotosint茅ticos, cianobacterias y bacterias fotosint茅ticas, la ferredoxina reducida por el fotosistema I podr铆a ser el donador fisiol贸gico de electrones para el enzima, si bien en bacterias no fotosint茅ticas la baja actividad de reducci贸n observada con ferredoxina y la necesidad de utilizar sistemas ex贸genos para reducirla, dejan abierto a discusi贸n su posible papel como donador fisiol贸gico (Losada y Guerrero, 1979).
En la actualidad, la 煤nica nitrato reductasa de procariotas que se ha conseguido purificar hasta un nivel aceptable (95% de pureza) ha sido la de la bacteria fotosint茅tica Rhodopseudomonas capsulata, encontr谩ndose, tras una purificaci贸n de solo 60 veces, que la prote铆na, de peso molecular 185 KD, tiene dos subunidades iguales de 85 KD cada una, no presenta FAD y s铆 un 谩tomo de molibdeno y 1 贸 2 grupos de hemo c por mol茅cula (ALef y Klemme, 1977, 1979). El enzima no acepta electrones de los pirid铆n nucle贸tidos reducidos, siendo su donador fisiol贸gico desconocido por el momento. La baja actividad espec铆fica (menos de 1 U/mg prote铆na), as铆 como el hecho de que preparaciones menos purificadas tuviesen actividades espec铆ficas superiores, es explicado por estos autores como la consecuencia de una destrucci贸n parcial del enzima durante la purificaci贸n (Alef y Klemme, 1979). Esto significa que a煤n cuando el enzima est茅 purificado, el conocimiento que de 茅l se tiene es escaso y adem谩s basado en un enzima de cuya integridad se duda.
El segundo enzima de la ruta de reducci贸n de nitrato, la nitrito reductasa, ha sido identificado en eucariotas fotosint茅ticos como una ferroprote铆na de 63 KD de peso molecular que carece de FAD y contiene un grupo sirohemo y un centro sulfof茅rrico del tipo {Fe4-S4*} (Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979; C谩rdenas et al., 1979; Lancaster et al., 1979). A diferencia de la nitrito reductasa de hongos, que contiene FAD que acepta electrones de los pirid铆n nucle贸tidos reducidos, la nitrito reductasa de algas verdes y plantas superiores, utiliza la ferredoxina reducida fotosint茅ticamente como donador de electrones (Losada y Guerrero, 1979; Vennesland y Guerrero, 1979; C谩rdenas et al., 1979), al igual que se ha encontrado para nitrito reductasa de cianobacterias (Manzano et al., 1976; Manzano, 1977; M茅ndez, 1979).
Las cianobacterias (alga verde-azuladas) constituyen un grupo perfectamente delimitado de microorganismos cuya presencia sobre la Tierra data de al menos 2.800 millones de a帽os (Schopf, 1970). La singularidad de este grupo reside en unir a una estructura celular procari贸tica, un aparato fotosint茅tico capaz de utilizar el agua como donador de de electrones, lo que le confiere una situaci贸n de puente entre las bacterias y las plantas superiores, de indudable inter茅s evolutivo, y biol贸gico en general (Fogg et al., 1973; Stanier y Cohen-Bazire, 1977).
De igual forma que otros organismos fototrofos, las cianobacterias asimilan compuestos de nitr贸geno inorg谩nico tales como nitrato, nitrito o amonio (Allen y Arnon, 1955), presentando algunas de ellas la capacidad de fijar nitr贸geno atmosf茅rico (Fogg et al., 1973). La importancia cuantitativa de la asimilaci贸n del nitr贸geno inorg谩nico por estos organismos puede resaltarse se帽alando que el nitr贸geno constituye del 4 al 9% del peso seco de las c茅lulas.
En contraposici贸n con el sistema reductor de nitrato de plantas superiores, algas y hongos, la informaci贸n existente sobre el proceso de reducci贸n de nitrato en cianobacterias es bastante escasa, aunque se ha demostrado que la reducci贸n transcurre v铆a nitrito en dos reacciones enzim谩ticas consecutivas (Hattori, 1962; Manzano et al., 1976, Manzano, 1977).
La nitrato reductasa de estos organismos se encuentra unida a membranas, pudiendo ser solubilizada por diversos procedimientos obteni茅ndose un enzima que es activo con donadores artificiales pero que no puede aceptar electrones de los pirid铆n nucle贸tidos (Hattori Myers, 1966, 1967; Hattori, 1970; Hattori y Uesugi, 1968a; Manzano et al., 1976).
Preparaciones particuladas de Anabaena cylindrica catalizan la reducci贸n de nitrato con ferredoxina como donador cuando se preparan empleando ultrasonidos, mientras que si se utilizan acetona para ello es el NADH y no la ferredoxina el donador de electrones efectivo encontrado (Hattori Myers, 1967). Cuando el enzima se solubiliza, solo los flav铆n nucle贸tidos, o los viol贸genos, reducidos sirven como donadores de electrones (Hattori, 1970). Sistemas reconstruidos de Anabaena cylindrica, empleando el sistema ascorbat/DPIP como donador de electrones del fotosistema I, llevan a cabo la reducci贸n de nitrato y nitrito dependiente de ferredoxina (Hattori Uesugi, 1968b).
En Anacystis nidulans y Nostoc muscorum se ha descrito la reducci贸n fotosint茅tica de nitrato por preparaciones de membranas que llevaban asociadas la actividad nitrato reductasa (Manzano et al., 1976; Ortega et al., 1976).
La ferredoxina parece ser el transportador de electrones entre el fotosistema I y el enzima, si bien en su ausencia a煤n ten铆a lugar una apreciable reducci贸n de nitrato.
Utilizando enzima soluble de A. nidulans ligeramente purificado se ha comprobado que la ferredoxina reducida por el sistema NADPH/NADP reductasa de espinacas, era capaz de donar electrones a la nitrato reductasa (Manzano et al., 1976; Manzano, 1977).
La reducci贸n de nitrato en cianobacterias es un proceso 铆ntimamente ligado a la fotos铆ntesis, habi茅ndose conseguido acoplar en preparaciones de membranas de A. nidulans, el poder reductor generado a partir del agua por el aparato fotosint茅tico a la reducci贸n de nitrato a amonio, con desprendiendo estequiom茅trico de ox铆geno (Candau et al., 1976).
En el presente trabajo se presentan evidencias aclaratorias de algunos puntos conflictivos sobre la reducci贸n de nitrato en cianobacterias y se aportan otras nuevas relativas a la participaci贸n de la ferredoxina como donador inmediato de electrones para la nitrato reductasa de A. nidulans.
Se ha desarrollado un procedimiento general de purificaci贸n de enzimas dependientes de ferredoxina, por cromatograf铆a de afinidad redox en geles de ferredoxina-Sefarosa, que se ha aplicado con 茅xito a la purificaci贸n hasta homogeneidad de NADP reductasa y nitrato reductasa de A. nidulans, habi茅ndose estudiado en especial algunas de las propiedades de este 煤ltimo enzima