EFHB is a novel cytosolic Ca²+ sensor that modulates STIM1-SARAF interaction

FUNDAMENTOS/OBJETIVOS: STIM1 y Orai1 son los componentes clave de la entrada de Ca2+ en la tienda (SOCE). Entre las proteínas que participan en la regulación de la SOCE, la SARAF previene la activación espontánea de la SOCE y modula la función de STIM1. MÉTODOS: Se estimó la movilización de Ca2+ citosólico en células cargadas de fura-2 usando un microscopio invertido de epifluorescencia. La interacción de STIM1 con Orai1, EFHB (miembro de la familia B del dominio de la mano EF, también conocido como CFAP21) y SARAF se detectó mediante inmunoprecipitación seguida de Western blotting utilizando anticuerpos específicos. La participación de EFHB en la translocación de NFAT al núcleo se detectó mediante microscopía confocal. RESULTADOS: Aquí reportamos la identificación del EFHB como un nuevo regulador SOCE. El EFHB interactúa con el STIM1 al agotarse el almacenamiento y se disocia a través de un mecanismo dependiente de Ca2+-. El silenciamiento mediado por el ARNi así como los estudios de sobreexpresión revelaron que el EFHB juega un papel relevante en la interacción de STIM1 y Orai1 al agotarse las reservas, la activación de la translocación de SOCE y NFAT del citosol al núcleo. El silenciamiento de la expresión de la EFHB suprimió la disociación de la SARAF de la STIM1, lo que indica que la EFHB podría desempeñar un papel importante en la interacción dinámica entre ambas proteínas, lo que es pertinente para la activación de los canales de Orai1 al agotarse el almacenamiento de Ca2+ y su posterior modulación mediante la inactivación lenta dependiente del Ca2+. CONCLUSIÓN: Nuestros resultados indican que el EFHB es un nuevo regulador SOCE que modula la interacción STIM1-SARAF.BACKGROUND/AIMS: STIM1 and Orai1 are the key components of store-operated Ca2+ entry (SOCE). Among the proteins involved in the regulation of SOCE, SARAF prevents spontaneous activation of SOCE and modulates STIM1 function. METHODS: Cytosolic Ca2+ mobilization was estimated in fura-2-loaded cells using an epifluorescence inverted microscope. STIM1 interaction with Orai1, EFHB (EF-hand domain family member B, also known as CFAP21) and SARAF was detected by immunoprecipitation followed by Western blotting using specific antibodies. The involvement of EFHB in the translocation of NFAT to the nucleus was detected by confocal microscopy. RESULTS: Here, we report the identification of EFHB as a new SOCE regulator. EFHB interacts with STIM1 upon store depletion and dissociates through a Ca2+- dependent mechanism. RNAi-mediated silencing as well as overexpression studies revealed that EFHB plays a relevant role in the interaction of STIM1 and Orai1 upon store depletion, the activation of SOCE and NFAT translocation from the cytosol to the nucleus. Silencing EFHB expression abolished the dissociation of SARAF from STIM1, which indicates that EFHB might play an important role in the dynamic interaction between both proteins, which is relevant for the activation of Orai1 channels upon Ca2+ store depletion and their subsequent modulation via slow Ca2+-dependent inactivation. CONCLUSION: Our results indicate that EFHB is a new SOCE regulator that modulates STIM1-SARAF interaction.• Ministerio de Economía y Competitividad. Contrato Juan de la Cierva IJCI-2015-25665, para Isaac Jardín Polo • Junta de Extremadura y Fondos FEDER. Contrato IB16046, para José Javier López Barba • Ministerio de Economía y Competitividad. Subvención BFU2016-74932-C2-1-P, para Letizia Albarrán Alonso • Ministerio de Economía y Competitividad. Subvenciones Subvenciones BFU2013-45564-C2-1-P/2-P y BFU2016-74932-C2-1-P/2-P • Junta de Extremadura y Fondos FEDER. Subvenciones IB16046 y GR18061peerReviewe

El páncreas perfundido y aislado como modelo de estudio de la secreción

El páncreas exocrino es uno de los modelos experimentales más empleados en el estudio de los mecanismos secretores. En las últimas dos décadas han tenido un gran auge diversas técnicas in vitro para el estudio de este órgano, lo que ha permitido desentrañar importantes fenómenos intracelulares. Sin embargo, en el organismo las células del páncreas se encuentran en condiciones muy distintas a las experimentales, lo que puede modificar su funcionalidad y cuestionar una parte de los resultados obtenidos in vitro. En cuanto a los estudios in vivo, adecuados para el estudio del control neuroendocrino de este órgano, no permiten la investigación de numerosos aspectos de la secreción pancreática, debido a limitaciones técnicas y de diseño experimental obvias.The exocrine pancreas is one of the most widely used experimental models in the study of secretory mechanisms. In the last two decades, various in vitro techniques have been booming for the study of this organ, which has made it possible to unravel important intracellular phenomena. However, in the organism, the cells of the pancreas are found in very different conditions from the experimental ones, which can modify their functionality and question some of the results obtained in vitro. As for in vivo studies, suitable for the study of the neuroendocrine control of this organ, they do not allow the investigation of numerous aspects of pancreatic secretion, due to obvious technical and experimental design limitations.peerReviewe

NO1, a New Sigma 2 Receptor/TMEM97 Fluorescent Ligand, Downregulates SOCE and Promotes Apoptosis in the Triple Negative Breast Cancer Cell Lines

ANTECEDENTES: Recientemente se ha publicado la estructura del receptor Sigma 2/TMEM97 (σ2RTMEM97). (2, 3) MÉTODOS Y RESULTADOS: Utilizamos enfoques genéticos y bioquímicos para identificar el mecanismo molecular aguas abajo de σ2R/TMEM97. El nuevo ligando fluorescente σ2R/TMEM97, NO1, redujo la proliferación y la supervivencia de las líneas celulares de cáncer de mama triple negativo (TNBC: líneas celulares MDA-MB-231 y MDA-MB-468), debido a la apoptosis inducida por NO1. También se demostró una mayor bioacumulación y una captación más rápida de NO1 en las células MDA-MB-231 en comparación con las líneas celulares MCF10A o MCF7. En consecuencia, la elevada expresión de σ2R/TMEM97 se confirmó mediante Western blotting. A diferencia de NO1, otros ligandos σ2R/TMEM97, como SM21 y PB28, potenciaron la proliferación y migración de las células MDA-MB-231. La entrada de calcio operada por almacenamiento (SOCE) es crucial para diferentes características del cáncer. Aquí demostramos que NO1, pero no otros ligandos σ2R/TMEM97, redujo la SOCE en células MDA-MB-231. Del mismo modo, el silenciamiento de TMEM97 en células MDA-MB-231 también afectó a SOCE. La administración de NO1 redujo la interacción STIM1-Orai1, probablemente al afectar al efecto regulador positivo de σ2R/TMEM97 sobre STIM1, ya que no pudimos detectar interacción con Orai1. (4) CONCLUSIONES: σ2R/TMEM97 es una proteína clave para la supervivencia de las células de cáncer de mama triple negativo mediante la promoción de SOCE; por lo tanto, NO1 puede convertirse en una buena herramienta farmacológica para evitar su proliferación.BACKGROUND: The structure of the Sigma 2 receptor/TMEM97 (σ2RTMEM97) has recently been reported. (2, 3) METHODS AND RESULTS: We used genetic and biochemical approaches to identify the molecular mechanism downstream of σ2R/TMEM97. The novel σ2R/TMEM97 fluorescent ligand, NO1, reduced the proliferation and survival of the triple negative breast cancer cell lines (TNBC: MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cell lines), due to NO1-induced apoptosis. Greater bioaccumulation and faster uptake of NO1 in MDA-MB-231 cells compared to MCF10A or MCF7 cell lines were also shown. Accordingly, elevated σ2R/TMEM97 expression was confirmed by Western blotting. In contrast to NO1, other σ2R/TMEM97 ligands, such as SM21 and PB28, enhanced MDA-MB-231 cell proliferation and migration. Store-operated calcium entry (SOCE) is crucial for different cancer hallmarks. Here, we show that NO1, but not other σ2R/TMEM97 ligands, reduced SOCE in MDA-MB-231 cells. Similarly, TMEM97 silencing in MDA-MB-231 cells also impaired SOCE. NO1 administration downregulated STIM1-Orai1 interaction, probably by impairing the positive regulatory effect of σ2R/TMEM97 on STIM1, as we were unable to detect interaction with Orai1. (4) CONCLUSION: σ2R/TMEM97 is a key protein for the survival of triple negative breast cancer cells by promoting SOCE; therefore, NO1 may become a good pharmacological tool to avoid their proliferation.• Ministerio de Industria, Economía y Competitividad. Proyectos BFU2013-45564C2-1-P y BFU2016-74932-C2-1-P • Junta de Extremadura y Fondos FEDER. Subvenciones GR18061 e IB16046 • Junta de Extremadura. Beca predoctoral PD16072, para Carlos Cantonero ChamorropeerReviewe

Neuroprotective properties of queen bee acid by autophagy induction

The datasets generated during and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.Versión en línea del registro antes de la inclusión en un número.Online versión of record before inclusión in an issue.Autophagy is a conserved intracellular catabolic pathway that removes cytoplasmic components to contribute to neuronal homeostasis. Accumulating evidence has increasingly shown that the induction of autophagy improves neuronal health and extends longevity in several animal models. Therefore, there is a great interest in the identification of effective autophagy enhancers with potential nutraceutical or pharmaceutical properties to ameliorate age-related diseases, such as neurodegenerative disorders, and/or promote longevity. Queen bee acid (QBA, 10-hydroxy-2-decenoic acid) is the major fatty acid component of, and is found exclusively in, royal jelly, which has beneficial properties for human health. It is reported that QBA has antitumor, anti-inflammatory, and antibacterial activities and promotes neurogenesis and neuronal health; however, the mechanism by which QBA exerts these effects has not been fully elucidated. The present study investigated the role of the autophagic process in the protective effect of QBA. We found that QBA is a novel autophagy inducer that triggers autophagy in various neuronal cell lines and mouse and fly models. The beclin-1 (BECN1) and mTOR pathways participate in the regulation of QBA-induced autophagy. Moreover, our results showed that QBA stimulates sirtuin 1 (SIRT1), which promotes autophagy by the deacetylation of critical ATG proteins. Finally, QBA-mediated autophagy promotes neuroprotection in Parkinson’s disease in vitro and in a mouse model and extends the lifespan of Drosophila melanogaster. This study provides detailed evidences showing that autophagy induction plays a critical role in the beneficial health effects of QBA.Open Access funding provided thanks to the CRUE-CSIC agreement with Springer Nature. This research was supported by a grant (IB18048) from Junta de Extremadura, Spain, and a grant (RTI2018-099259-A-I00) from Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain. This work was also partially supported by “Fondo Europeo de Desarrollo Regional” (FEDER) from the European Union. Part of the equipment employed in this work has been funded by Generalitat Valeciana and co-financed with ERDF funds (OP EDRF of Comunitat Valenciana 2014-2020). G.M-C is supported by University of Extremadura (ONCE Foundation). M.P-B is a recipient of a fellowship from the “Plan Propio de Iniciación a la Investigación, Desarrollo Tecnológico e Innovación (University of Extremadura).” S.M.S.Y-D is supported by CIBERNED. E.U-C was supported by an FPU predoctoral fellowship FPU16/00684 from Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. A.B. was supported by a postdoctoral fellowship (APOSTD2017/077). M.S.A. was supported by a predoctoral fellowship (ACIF/2018/071) both from the Conselleria d’Educació, Investigació, Cultura i Esport (Generalitat Valenciana). E.A-C was supported by a grant (IB18048) from Junta de Extremadura, Spain. S.C-C was supported by an FPU predoctoral fellowship FPU19/04435 from Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. J.M.B-S. P was funded by the “Ramón y Cajal” program (RYC-2018-025099). J.M.F. received research support from the Instituto de Salud Carlos III, CIBERNED (CB06/05/004). M.N-S was funded by the “Ramon y Cajal” Program (RYC-2016-20883) Spain.peerReviewe