Protection against nitric oxide genotoxicity by Ginkgo biloba extract

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DNA protective effect of Ginkgo biloba extract persists after simulation of the human digestion in vitro

This work is supported by: European Investment Funds by FEDER/COMPETE/POCI– Operational Competitiveness and Internationalization Programme, under Project POCI-01-0145-FEDER-006958 and National Funds by FCT - Portuguese Foundation for Science and Technology, under the project UID/AGR/04033/2013.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Actividade protectora de extractos vegetais contra a genotoxicidade do óxido nítrico

Dissertação de mestrado em Genética MolecularA good reputation regarding the use of plant extracts has been growing consistently over the last years, the potential benefits of their use being heavily supported by the literature. However, as most studies aspire very little by investigating only their antioxidant activities, a lot of work remains to be done on other activities, such as antigenotoxicity. Excessive production of oxidative species, such as reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS), can reveal to be harmful to the cell. Amongst various targets, these molecules can affect DNA and may lead to the loss of its stability and integrity, imposing a very dangerous threat to survival. Base excision repair (BER) and homologous recombination (HR) are two major DNA repair mechanisms of the cell, and are responsible for the repair of several forms of DNA damage, including base modification and strand breakage. SNP is a NO-releasing agent and can be used to simulate an excessive increase of NO production inside the cell. NO may oxidize in many different compounds, depending on the molecules it encounters within the cell. The most damaging oxidation products include peroxynitrite and dinitrogen trioxide, a very powerful oxidant and a very strong nitrosating agent, respectively, both being able to directly interact and modify DNA. This project purposed to investigate the protective properties of extracts of Dittrichia viscosa (DVE) and Ginkgo biloba (GBE) against NO-mediated genotoxicity and in what ways protection occurs by using the Schizosaccharomyces pombe model. In the end, the chemical profiles of DVE and GBE agreed with many published others, as most of the detected molecules were also detected in those studies. In vitro assays revealed a relatively (to standard) low IC50 values of DVE in DPPH reduction and iron chelating activity and GBE in DPPH reduction and NO scavenging. DVE did not provide viability protection against NO-mediated damage. GBE, however, was able to protect the studied BER and HR Sch. pombe mutants. Additionally, treatment with GBE alone significantly induced a quicker progression of cell cycle and slightly attenuated the delay produced by SNP treatment. Both extracts appear to activate oxidative-stress response through Pap1, although the prevention of oxidative stress by SNP was not achieved in either cases. In conclusion, GBE protection appears to be independent of BER and it may result from a combination of effects including the scavenging of NO, the generated ROS and RNS by flavonoids and the activation of oxidativestress response proteins.Nos últimos anos, tem-se vindo a construir uma boa reputação no que toca ao uso de extractos vegetais, sendo os seus potenciais benefícios fortemente suportados pela literatura. No entanto, a maioria dos estudos aspira a muito pouco ao investigar apenas as suas actividades antioxidantes, pelo que há muito trabalho a ser feito em relação a outras actividades, como a antigenotoxicidade. A produção excessiva de espécies oxidativas, como as espécies reativas de oxigénio (ROS) e de nitrogénio (RNS), podem revelar-se prejudicial à célula. Entre os seus vários alvos, estas moléculas podem afectar o DNA, podendo levar à perda da sua estabilidade e integridade, impondo assim uma grave ameaça à sobrevivência. A reparação por excisão de bases (BER) e a recombinação homóloga (HR) são dois dos principais mecanismos de reparação de DNA da célula e são responáveis pela reparação de vários tipos de danos no DNA, incluindo modificações de bases e quebras de cadeia. O nitroprussiato de sódio é um agente que liberta NO e pode ser utilizado para simular um aumento excessivo da produção de NO por parte da célula. O NO é capaz de oxidar em muitos compostos diferentes, dependendo das moléculas que encontra dentro da célula. Os produtos de oxidação mais prejudiciais são o peroxinitrito e o trióxido de dinitrogénio, um poderoso oxidante e um forte agente nitrosante, respectivamente, sendo ambos capazes de interagir e modificar directamente o DNA. Este projecto pretendeu investigar as propriedades protectoras de extractos de Dittrichia viscosa (DVE) e Ginkgo biloba (GBE) contra a genotoxicidade do NO e de que forma essa protecção ocorreria, recorrendo ao modelo de Schizosaccharomyces pombe. No fim, os perfis químicos de DVE e GBE foram semelhantes a muitos outros publicados, pelo que a maioria das moléculas detectadas foram também detectadas nesses estudos. Os ensaios in vitro revelaram valores de IC50 relativamente (ao padrão) baixos para DVE na reducção do DPPH e na actividade quelante do ferro e para GBE na reducção do DPPH e na eliminação do NO. DVE não proporcionou protecção da viabilidade contra danos induzidos pelo NO. GBE, no entanto, foi capaz de proteger estirpes de Sch. pombe mutantes na BER e HR. Ainda, o tratamento apenas com GBE induziu uma progressão significativamente mais rápida do ciclo celular e atenuou ligeiramente o atraso produzido pelo tratamento com SNP. Ambos os extractos pareceram activar a resposta a stress oxidativo através da Pap1, embora a prevenção do stresse oxidativo induzido pelo SNP não tenha acontecido em nenhum dos casos. Concluindo, a protecção pelo GBE parece ser independente da BER e deve resultar de uma combinação de efeitos, incluindo a eliminação do NO, dos ROS e dos RNS gerados por parte dos flavonóides e a activação de proteínas de resposta a stress oxidativo