Steroid hormones content and proteomic analysis of canine follicular fluid during the preovulatory period

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Follicular fluid contains substances involved in follicle activity, cell differentiation and oocyte maturation. Studies of its components may contribute to better understanding of the mechanisms underlying follicular development and oocyte quality. The canine species is characterized by several ovarian activity features that are not extensively described such as preovulatory luteinization, oocyte ovulated at the GV stage (prophase 1) and poly-oocytic follicles. In this study, we examined the hypothesis that the preovulatory LH surge is associated with changes in steroid and protein content of canine follicular fluid prior to ovulation.</p> <p>Methods</p> <p>Follicular fluid samples were collected from canine ovaries during the preovulatory phase, before (pre-LH; n = 16 bitches) and after (post-LH; n = 16) the LH surge. Blood was simultaneously collected. Steroids were assayed by radioimmunoassay and proteomic analyses were carried out by 2D-PAGE and mass spectrometry.</p> <p>Results</p> <p>The concentrations of 17beta-estradiol and progesterone at the pre-LH stage were 737.2 +/- 43.5 ng/ml and 2630.1 +/- 287.2 ng/ml in follicular fluid vs. 53 +/- 4.1 pg/ml and 3.9 +/- 0.3 ng/ml in plasma, respectively. At that stage, significant positive correlations between follicular size and intra-follicular steroid concentrations were recorded. After the LH peak, the intrafollicular concentration of 17beta-estradiol decreased significantly (48.3 +/- 4.4 ng/ml; p < 0.001), whereas that of progesterone increased (11690.2 +/- 693.6 ng/ml; p < 0.001). Plasmatic concentration of 17beta-estradiol was not modified (49 +/- 9.6 pg/ml) after the LH peak, but that of progesterone significantly increased (9.8 +/- 0.63 ng/ml).</p> <p>Proteomic analysis of canine follicular fluid identified 38 protein spots, corresponding to 21 proteins, some of which are known to play roles in the ovarian physiology. The comparison of 2D-PAGE patterns of follicular fluids from the pre- and post-LH stages demonstrated 3 differentially stained single spot or groups of spots. One of them was identified as complement factor B. A comparison of follicular fluid and plasma protein patterns demonstrated a group of 4 spots that were more concentrated in plasma than in follicular fluid, and a single spot specific to follicular fluid. These proteins were identified as gelsolin and clusterin, respectively.</p> <p>Conclusion</p> <p>Our results provide the first demonstration of size-related changes in the steroid concentrations in canine follicular fluid associated with the LH surge. 2D protein mapping allowed identification of several proteins that may play a role in follicle physiology and ovarian activity at the preovulatory stage. This may help in the future to explain and to better understand the species specificities that are described in dogs.</p

Mechanisms influencing the sex ratio in cattle.

peer reviewedLe sexe ratio (proportion de veaux mâles nés) peut varier sous l’effet de nombreux facteurs (voir l’article dans un numéro précédent). Les mécanismes d’action biologiques expliquant ces variations sont potentiellement nombreux. Tout d’abord l’origine des ovocytes (le sexe ratio varie entre l’ovaire droit et l’ovaire gauche), alors que l’influence de la corne qui héberge le fœtus ne semble pas avoir d’influence. Les spermatozoïdes porteurs du chromosome Y seraient plus rapides mais moins résistants que les spermatozoïdes porteurs du X, expliquant l’influence du moment de l’insémination par rapport à l’ovulation (influence néanmoins non systématiquement observée). La glycémie de la mère orienterait le sexe ratio par un impact sur la maturation ovocytaire et sur le début du développement embryonnaire, les embryons montrant des différences dans leur métabolisme et dans leur résistance au stress. Néanmoins, ces mécanismes restent hypothétiques et mal élucidés

Follicular growth and ovulation in the queen

The queen is a seasonally polyoestrus, induced ovulator. Due to the limited follicular size, clinical follow-up of terminal follicular growth is difficult in this species. In this study, ovarian ultrasonography has been performed during 9 anovulatory cycles and 12 ovulatory cycles. Follicles appeared as well-defined anechoic circular zones. Mean estrus duration was 7.4 days. On the first day of behavioural estral modifications, 4.8 ± 0.2 follicles (2-7 per female) of 2.3 ± 0.01 mm mean diameter were present on the ovaries. Follicular growth continues at a rate of 0.2 ± 0.04 mm per day. At least one follicle of the cohort reaches a diameter greater than 3.0 mm. Maximal follicular growth was reached 3.8 ± 0.3 days after the onset of estrus and the diameter of the largest follicle was 3.5 ± 0.04 mm. In the absence of ovulation, follicular diameter decreased from 0.1 ± 0.01 mm per day until the end of estrus. The first day after the end of behavioural estrus, the diameter of the largest follicle of each cohort was 2.7 ± 0.05 mm. When ovulation was mechanically induced, it began 23 to 28 hours after vaginal stimulations and lasted 10 hours. It was visualized by anechoic images disparition. No correlation has been observed between follicular development and either vaginal smear characteristics, or time spent from the onset of estrus. Ultrasonography revealed to be the more reliable technique to examine the follicular development and its main interest is the determination of the optimal time for ovulation induction before artificial insemination.La chatte est une femelle à polyoestrus saisonnier et à ovulation provoquée. Compte tenu de la faible taille des follicules, le suivi clinique de la croissance folliculaire terminale est difficile dans cette espèce. Les ovaires ont été observés au cours de 9 cycles anovulatoires et 12 cycles ovulatoires grâce à un échographe de très haute résolution. Les follicules apparaissent sous forme de zones circulaires anéchogènes bien délimitées. Les chaleurs durent en moyenne 7,4 jours. Le premier jour d'apparition des manifestations comportementales de l'œstrus, 4,8 ± 0,2 follicules (entre 2 et 7 par chatte) sont présents avec un diamètre moyen de 2,3 ± 0,01 mm. La croissance des follicules se poursuit ensuite à raison de 0,2 ± 0,04 mm par jour. Au moins un follicule de la cohorte atteint un diamètre supérieur à 3 mm. La croissance folliculaire maximale est atteinte 3,8 ± 0,3 jours en moyenne après le début des chaleurs; le diamètre du plus gros follicule est de 3,5 ± 0,04 mm. En l'absence d'ovulation, le diamètre folliculaire diminue d'en moyenne 0,1 ± 0,01 mm par jour jusqu'à la fin des chaleurs. Le premier jour d'arrêt des manifestations comportementales, le diamètre du plus gros follicule de chaque cohorte est de 2,7 ± 0,05 mm. Lorsqu'elle est induite par stimulation vaginale, l'ovulation débute 23 à 28 heures après la première stimulation et s'étale sur environ 10 heures. Elle se traduit par la disparition des images anéchogènes. Cette étude montre que le stade de croissance folliculaire ne peut être relié ni aux caractéristiques du frottis vaginal ni à la durée écoulée depuis le début des manifestations comportementales. L'échographie semble être la technique la plus fiable pour déterminer le stade de croissance folliculaire et donc décider du moment optimal d'induction de l'ovulation en vue de l'insémination

Polyovular ovarian follicles: physiological and not so rare

In mammalian ovaries, the vast majority of follicles contain only one oocyte. However, follicles containing several oocytes, or polyovular follicles, are also found in most species. Their frequency ranges from < 0.1% to 14% of the total number of follicles, and they can contain from 2 to 17 oocytes (or even 100 in certain marsupials). Three hypotheses have been proposed to explain their occurrence: division of an oocyte initially containing several nuclei, fusion of several different follicles, or nonseparation of several oocytes at the time of the formation of the primordial follicles. This latter hypothesis seems the most likely. The fate of these follicles has not been studied extensively, and for a long time they were considered as pathological. Studies conducted in pigs and dogs have shown that these polyovular follicles can grow, reach the preovulatory stage, and ovulate. However, all the oocytes in a single follicle are not equal. The examination of oocytes retrieved from a single follicle suggests that only one oocyte shows good morphological characteristics, whereas the others are at various stages of more or less advanced degeneration. The regulation of the number of polyovular follicles is still poorly understood and the data on the effects of age, gonadotropins, and steroids is contradictory. Their frequency can be increased by using treatments with estrogenic effects, or endocrine disruptors. In mice, the control is also genetic. The mechanisms leading to the formation of polyovular follicles remain to be explored, and the study of the functioning of these particular follicles would improve our understanding of the oocyte-follicle dialogue.Dans les ovaires des mammifères, la très grande majorité des follicules ne contient qu'un seul ovocyte. Mais, dans la plupart des espèces, certains follicules contiennent plusieurs ovocytes: on parle alors de follicules polyovocytaires ou multiovocytaires. Leur fréquence varie entre <0.1 % et 14% des follicules totaux et ils peuvent contenir de 2 à 17 ovocytes (et même plus de 100 chez certains marsupiaux). Trois hypothèses pourraient expliquer leur formation: la division d'un ovocyte ayant initialement plusieurs noyaux, la fusion de plusieurs follicules différents ou la non-séparation de plusieurs ovocytes au moment de la formation des follicules primordiaux. Cette dernière hypothèse semble la plus probable. La destinée de ces follicules a été encore peu explorée et ils ont été longtemps considérés comme pathologiques. Des travaux menés notamment chez le porc et le chien montrent que ces follicules polyovocytaires peuvent grandir, atteindre le stade préovulatoire et ovuler. Cependant, tous les ovocytes d'un même follicule ne sont pas équivalents. L'observation des ovocytes après ponction du follicule suggère qu'un seul ovocyte semble de bonne qualité morphologique, tandis que les autres sont à des stades de dégénérescence plus ou moins avancés. La régulation du nombre des follicules polyovocytaires est peu connue et il existe des données contradictoires sur les effets de l'âge, des gonadotrophines et des stéroïdes. Leur fréquence peut être augmentée par des traitements à effets œstrogéniques ou par l'action de perturbateurs endocriniens. Chez la souris, le contrôle est également génétique. Les mécanismes conduisant à la formation des follicules polyovocytaires restent à explorer et l'étude du fonctionnement de ces follicules pourrait contribuer à une meilleure connaissance du dialogue ovocyte-follicule

In vitro maturation of canine oocyte

Compared to other mammals, the canine oocyte offers a very unusual model of meiosis. Its maturation in vitro, studied only over the past ten years, is still poorly controlled: low rate of metaphase II (10 to 20% vs. over 90% in cattle), and high rate of degeneration in cultures (20 to 60%) despite attempts to improve culture media. However, in dogs as well as in canidae threatened by extinction, in vitro maturation is a key step for reproductive biotechnologies, such as in vitro fertilization and embryo production. It is therefore urgent to improve our understanding of the canine oocyte to improve maturation rates. We initiated studies on oocyte maturation in bitches. We examined the role of cAMP in the resumption of meiosis in vitro in bitches, using substances which reduce (Rp-cAMP) or increase (dbcAMP and forskolin) its level inside the oocyte. We also used denuded oocytes to prevent any cAMP supply from the granulosa cells. With this model, we showed that cAMP might play a role in maintaining meiosis, and that the resumption of meiosis may also be controlled by another pathway, possibly involving calcium. Another of our research projects explores changes in the oocyte ultrastructure during in vivo and in vitro maturation. Transmission electron microscopy may provide precise information on possible cytoplasmic anomalies induced by maturation. This fundamental work will eventually help us improve in vitro maturation of canine oocytes.L'ovocyte de chienne constitue un modèle de méiose très particulier parmi les mammifères. Sa maturation in vitro, étudiée depuis une dizaine d'années seulement, reste très mal maîtrisée : faible taux de métaphase II (10 à 20 % contre plus de 90 % chez les bovins) et fort taux de dégénérescence en culture (20 à 60 %) malgré les essais d'amélioration des milieux de culture. Or la maturation in vitro est une étape indispensable pour avoir accès, tant chez le chien que chez les Canidés en voie de disparition, aux biotechnologies de la reproduction (fécondation et production d'embryons in vitro notamment). Il est indispensable de mieux comprendre la biologie de l'ovocyte chez la chienne pour améliorer les taux de maturation. Nous nous sommes intéressées, en premier lieu, au rôle de l'AMPc dans la reprise de la méiose in vitro. Nous avons modulé la concentration intraovocytaire d'AMPc en soumettant les ovocytes à des molécules qui la diminuent (Rp-AMPc) ou l'augmentent (dbAMPc et forskoline), ou en dénudant l'ovocyte pour arrêter tout apport par les cellules du cumulus. Nous avons ainsi montré que l'AMPc jouerait un rôle dans la poursuite de la méiose dont la reprise serait également contrôlée par une autre voie, peut-être calcique. En parallèle, nous explorons l'évolution de l'ultrastructure de l'ovocyte au cours de la maturation in vivo et in vitro, pour détecter les anomalies cytoplasmiques qui peuvent apparaître au cours de la maturation

Oviductal microenvironment: role in canine oocyte maturation in vivo and in vitro

In most mammals, oocytes are ovulated at the metaphase II stage, and the meiosis inhibition is then lifted by fertilization. In bitches and other Canidae species however, oocytes are released at the prophase I stage, and another 48 to 72h are necessary for themtomature into themetaphase II stage and become fertilizable. This specificity is currently hindering the development of reproductive biotechnologies in these species. In vitro maturation rates of canine oocytes are very low, as only 10 to 30%will reach the metaphase stage after 72h in culture. In bitches, nuclear maturation occurs in the oviduct, and tubal derivatives (culture media, such as Synthetic Oviductal Fluid, oviductal explants, coculture on tubal cell layers) were used to improve the yield, but so far not very successfully. This failure may be due to the lack of data on the composition of oviductal fluid in bitches. Further studies on the oviductal microenvironment of bitches are therefore necessary, as it is probably quite different from the oviductalmicroenvironment of other females, e.g. the presence of preovulatory luteinisation in bitches only. Creating a maturation medium based on the composition of oviductal fluid could be an interesting avenue to explore to improve in vitro maturation rates.Chez la plupart des mammifères, les ovocytes sont bloqués en métaphase II au moment de l'ovulation et cette inhibition de la méiose est ensuite levée par la fécondation. Chez les chiennes et les autres femelles de canidés, les ovocytes sont libérés au stade de prophase I, et il faut encore attendre 48 à 72 heures pour qu'ils atteignent le stade de métaphase II et deviennent fécondables. Cette particularité constitue aujourd'hui un frein au développement des biotechnologies de la reproduction chez les canidés. En effet, dans les essais de maturation in vitro d'ovocytes canins, seuls 10 à 30 % des ovocytes atteignent le stade de métaphase au bout de 72 heures de culture. Chez la chienne, la maturation nucléaire se produisant dans l'oviducte, des substituts de l'oviducte (milieux de culture comme le Synthetic Oviductal Fluid, explants d'oviductes, cultures sur tapis de cellules tubaires) ont été utilisés pour les cultures d'ovocytes in vitro, afin d'en améliorer le rendement, mais sans grand succès jusqu'à maintenant. Cet échec peut être dû au manque de données sur la composition du liquide tubaire de la chienne. L'étude de ce microenvironnement prend donc tout son intérêt, celui-ci étant probablement assez différent de celui des autres femelles, ne serait-ce que par l'existence du processus de lutéinisation préovulatoire dans cette espèce. À terme, la conception d'un milieu de maturation sur la base de la composition du liquide tubaire pourrait être une voie intéressante pour augmenter les taux de maturation in vitro

Canine oocyte maturation, fertilization and early embryonic development

Canine reproduction has several distinctive features. Firstly, folliculogenesis is unusual as numerous ovarian follicles contain several oocytes (polyovular follicles). Secondly, unlike in other mammalian species, oocytes at the time of ovulation are still at an immature stage (prophase I, germinal vesicle stage), and complete their maturation in the oviduct. This phenomenon is not easy to observe because the canine oocyte has a high lipid content and its DNA is difficult to visualise. Fertilization of immature oocytes has been observed in vitro, however in vivo, fertilization occurs in oocytes at the metaphase II stage, approximately 50 hours after ovulation. The 2-pronuclei stage is reached 72-124 hours after ovulation, and 2-cell embryos are present 96-168 hours after ovulation. The oviductal phase is long and embryos enter the uterine cavity at the morula or early blastocyst stage 10-12 days following ovulation. Implantation occurs 18 to 21 days after ovulation. In spite of all these specificities, studies on canine reproduction were so far mainly clinical. However, current research is focusing on fundamental knowledge, namely the mechanisms controlling oocyte maturation in vivo, in the hope to improve the yield of oocyte maturation in vitro, which is still very low.Plusieurs aspects de la reproduction sont particuliers à l'espèce canine. D'une part, la folliculogenèse est singulière car chez la chienne, de nombreux follicules ovariens contiennent plusieurs ovocytes (follicules poly-ovocytaires). D'autre part, contrairement à ce qui est observé chez les autres femelles de mammifères, au moment de l'ovulation, l'ovocyte est encore à un stade immature (prophase I, stade vésicule germinative ou VG) et la maturation ovocytaire se poursuit ensuite dans l'oviducte. L'observation de ce phénomène est rendue complexe par le fait que l'ovocyte canin est riche en lipides et que son ADN est donc difficile à visualiser. In vitro, la fécondation d'ovocytes immatures a été observée mais in vivo, elle a lieu au moment où les ovocytes ont atteint le stade métaphase II, environ 50 h après l'ovulation. Les premiers pronoyaux sont présents 72 à 124 h après l'ovulation et les premiers embryons au stade 2-cellules sont observés 96 à 168 h après l'ovulation. La période de transit dans l'oviducte est longue et les embryons n'atteignent l'utérus qu'au stade morula ou jeune blastocyste, 10 à 12 jours après l'ovulation et l'implantation a ensuite lieu vers 18 à 21 jours. Globalement, malgré toutes ces particularités, les recherches sur la reproduction dans l'espèce canine étaient jusqu'alors essentiellement cliniques. Les travaux visent maintenant à améliorer les connaissances fondamentales, notamment concernant les mécanismes contrôlant la maturation ovocytaire in vivo, pour pouvoir ensuite améliorer les rendements de la maturation in vitro, actuellement très faibles

Birth weight as a risk factor for neonatal mortality: Breed-specific approach to identify at-risk puppies

Abstract: In numerous species, low birth weight is a risk factor for neonatal mortality. In the canine species, definition of a low birth weight is complex due to the huge interbreed variability in size. To identify puppies at higher risk of neonatal death, data from 6,694 puppies were analysed. The data were collected from 75 French breeding kennels, examining 27 breeds and totaling 1,202 litters of puppies. Generalised linear mixed models allowed to identify birth weight, birth weight heterogeneity within the litter, and size of the breeding kennel as significant risk factors for neonatal mortality. Receiver Operating Characteristics (ROC) and classification and regression tree (CART) analyses were combined to define breed specific thresholds for birth weight allowing the identification of puppies at higher risk of neonatal mortality. Due to differences in birth weights between breeds, including when belonging to the same breed size, analyses were conducted at the breed level. First, ROC analysis thresholds were successfully established for 12 breeds (area under the ROC ≥ 0.70; sensitivity ≥ 75%; specificity: 45–68%) and they ranged from 162 g in the Maltese to 480 g in the Bernese Mountain dog. Secondly, CART analysis thresholds from 22 breeds ranged from 105 g in the Maltese and 436 g in the Boxer. Puppies were grouped into three categories according to birth weight: low, moderate and high risk of neonatal mortality (higher than the ROC threshold, between ROC and CART thresholds, and lower than the CART threshold respectively). In the current study, 44% of the puppies were classified as at moderate risk and 5.3% for a high risk of neonatal mortality. Thresholds defined by CART analysis (and not ROC analysis) were used to define low birth weight puppies and were sometimes quite different between breeds with similar birth weight distributions suggesting a variable relationship between birth weight reduction and neonatal death. These results allow the identification of puppies at an increased risk of neonatal death, thus requiring specific nursing to improve their chances of survival. With these high risk puppies identified, both animal welfare and kennel productivity is predicted to improve

Embryo biotechnologies in dogs

There is very little data available on the specificities of oocyte and embryo biology in bitches. The main difference with other mammals is the time of meiosis resumption: it does not occur before ovulation, but in the oviduct 48 to 60 hours later. The factors responsible for this delay are not known, which may explain why current in vitro maturation rates are so low (10 to 30%). Oocyte harvesting is also a major limiting factor, as there is no effective protocol for the induction of cycles and superovulation. In vitro fertilisation rates are equally low (10%), with a high rate of polyspermia. No puppy has yet been born from an embryo produced in vitro. As for embryos produced in vivo, their collection is difficult due to anatomical reasons and to the fact that superovulation cannot be induced. Embryo transfer to donor bitches is also hindered by difficulties to synchronise ovulations between donor and recipient bitches. Only 6 such trials have been reported in the literature, resulting in the birth of 45 puppies. In vitro cultures are very rarely used, and only four puppies were born from somatic cell cloning with only few hours of in vitro culture. Canine reproductive biotechnologies have thus largely fallen behind, due to a lack of fundamental research to improve our understanding of its specific physiological mechanisms. This deficit is all the more damaging that dogs are increasingly used as relevant biomedical models.La biologie de l'ovocyte et de l'embryon canins, qui présentent des particularités spécifiques, est très mal connue. La chienne se distingue principalement par les modalités de reprise de la méiose ovocytaire : celle-ci n'a pas lieu au moment de l'ovulation, comme chez les autres femelles mammifères, mais dans l'oviducte 48 à 60 heures après l'ovulation. Les facteurs responsables de ce retard ne sont pas connus. Ceci explique sans doute pourquoi les taux de maturation in vitro obtenus à l'heure actuelle sont faibles (10 à 30 %). La collecte des ovocytes est aussi un facteur limitant majeur, en l'absence de protocole efficace d'induction des cycles et de superovulation. Les rendements de fécondation in vitro sont également faibles (10 %), avec un taux élevé de polyspermie. À l'heure actuelle, aucun chiot n'est encore né à partir d'un embryon produit in vitro. Quant aux embryons produits in vivo, leur collecte est difficile pour des raisons anatomiques et le rendement est limité par l'impossibilité d'induire des superovulations; par ailleurs, leur transfert chez des femelles receveuses se heurte aux difficultés de synchronisation des ovulations entre la femelle donneuse et les receveuses, et la littérature ne décrit que six essais, qui ont abouti à la naissance de 45 chiots. Avec un très faible recours à la culture in vitro, quatre naissances de chiots ont été obtenues par clonage de cellules somatiques. Les biotechnologies de la reproduction sont donc largement en retard dans l'espèce canine, qui souffre d'un manque de travaux fondamentaux visant à mieux comprendre ses mécanismes physiologiques spécifiques. Ce déficit est d'autant plus dommageable que le chien prend une place croissante et pertinente en tant que modèle biomédical

La contamination foetale par la BVD et son contrôle

National audienceL’infection d’une vache par le virus BVD au cours de la gestation peut entrainer la perte du conceptus, des malformations congénitales ou la naissance d’un veau infecté persistant immunotolérant (IPI). La transmission transplacentaire du virus est un phénomène efficace mais mal connu. Avant l'établissement d’une virémie maternelle, le virus atteint l’allantoïde et l’amnios, puis le fœtus vers l’endomètre. Lors d’une vaccination, les immunoglobulines neutralisent le virus avant qu’il n’atteigne le fœtus. Il n’y a cependant pas de corrélation entre le titre en anticorps neutralisants et le degré de protection fœtale. Deux vaccins BVD actuellement commercialisés en France ont un label « protection fœtale »