Accumulation de la proteine soluble (PR 1a) dans les interactions Nicotiana tabacum/Phytophthora spp

National audienceThe aim of this study was to compare the kinetics of PR 1a accumulation in different types of interaction between 4 genotypes of N tabacum and 5 isolates of Phytophthora ssp. It was first shown by PAGE that PR 1a was predominantly induced in the 4 genotypes. The quantification of PR 1a induced in the 2 leaves under the inoculation point was performed by an immunoenzymatic technique (DAS-ELISA). P parasitica var nicotianae (NIC) isolates are the only ones compatible with N tabacum. Specific incompatibility (vertical resistance) controlled by the gene R1 occurs between 46-8 Helgeson’s line and isolates NIC 183, NIC 310 race r0, whereas isolate NIC 181 race r1 overcomes it. The variety Xanthi nc and Hegelson’s line 49-10 are susceptible to both races. General incompatibility (non-host resistance) is observed between all N tabacum genotypes and isolates of Phytophthora ssp other than P parasitica var nicotianae, for instance P cryptogea (CRY 52) and P parasitica sensu lato (PAR 44). It has been demonstrated that incompatible species are more or less able to induce foliar necrosis without colonization and that their culture filtrates contain a protein elicitor (elicitin) identified respectively as cryptogein and parasiticein. Healthy plants of the 4 genotypes contain different amounts of PR 1a, ranging from 0.03 μg/gFW in Xanthi nc to 6.6 μg/gFW in Escambray. However, this level of PR 1a is not correlated with varietal resistance, either specific or nonspecific. The resistance process in the specifically incompatible interaction 46-8 (R1)/NIC 183 race r0 is not associated with a noticeable increase of PR 1a in the leaves (table IV). In the compatible interactions, petiole colonization and foliar wilt are followed by a high level of PR la accumulation in Escambray reaching > 700 μg/gFW (table III). In the incompatible interactions, interpretation of the accumulation kinetics is more complex: early induction on the first day after inoculation could be directly stimulated by elicitins. This response depends on the varietal genotype: only Xanthi nc responds to parasiticein. Afterwards, a higher amount of PR la found on the fourth and seventh days in 46-8 and 49-10 lines inoculated with CRY 52 could be directly related to foliar necrosis; this peak is apparently absent in the same genotypes inoculated by the non-necrotic isolate PAR 44. In conclusion, from our results it seems that all necrotic reactions induced by incompatible Phytophthora species or foliar invasion by compatible strain release a large amount of PR 1a. On the other hand, no direct relation between any resistance state and PR 1a accumulation has been clearly established.Le but de ce travail était de comparer les cinétiques d’accumulation de PR 1a, dans les différents niveaux d’interactions entre 4 génotypes de Nicotiana tabacum et 5 isolats de Phytophthora sp. Nous avons dans un premier temps vérifié sur gel de polyacrylamide que la protéine PR 1a était majoritaire parmi les protéines de type PR dans les 4 génotypes. La quantification de la protéine PR 1a a été réalisée par la méthode immunoenzymatique DAS-Elisa, à partir d’extraits séparés des 2 feuilles situées immédiatement après le point d’inoculation de la tige. Les isolats de Phytophthora parasitica var nicotianae (NIC 181, NIC 183, NIC 310) agent du black shank sont seuls compatibles avec le N tabacum. Une incompatibilité spécifique s’établit entre les variétés possédant le gène R1 (lignée d’Helgeson 46-8) et la race physiologique commune r0 du champignon parasite. Cette résistance est surmontée par l’isolat de race r1 (NIC 181). Certaines variétés, comme Escambray, possèdent une tolérance ou résistance non spécifique aux isolats de race 0 et 1. Les variétés Xanthi nc et la lignée 49-10 d’Helgeson sont sensibles aux 2 races. Enfin l’incompatibilité générale (résistance «plante non hôte») peut être observée entre ces 4 génotypes et les 2 espèces étudiées de Phytophthora : P cryptogea (CRY 52) et P parasitica sensu lato (PAR 44) productrices d’élicitine (E+). Les 4 variétés ou lignées étudiées renfermaient avant décapitation de la tige et inoculation des quantités variables de PR 1a (0,03 μg/gMF à 6,6 μg/gMF), celles-ci non corrélées à la résistance générale. La réaction de résistance de la lignée 46-8 (R1) à la race physiologique r0, n’a pas été marquée par une accumulation de PR 1a. Dans les interactions compatibles, le flétrissement du limbe foliaire, envahi par le parasite, s’accompagne dans tous les cas d’une accumulation importante de PR 1a (pouvant atteindre plus de 700 μg/gMF pour Escambray à J7). En ce qui concerne les interactions incompatibles de type plante «non hôte», l’interprétation des cinétiques observées est plus complexe. Une induction précoce de PR 1a à J1 pourrait être liée à l’action des éliciteurs produits par les espèces P cryptogea et P parasitica ; l’accumulation plus tardive est beaucoup plus élevée entre J4 et J7 serait la conséquence indirecte des nécroses induites par la seule souche nécrosante P cryptogea. Chez Xanthi nc, elle n’a pas été observée dans les interactions avec P parasitica sensu lato qui n’a pas provoqué de nécrose à distance. Toute réaction nécrotique à distance ou envahissement des limbes s’accompagne d’une accumulation de PR 1 a, mais nous n’avons pu mettre en évidence de relation directe entre la résistance et la synthèse de PR 1a

Relations serologiques entre la capside non degradee et les antigenes solubles de differentes souches du virus de la mosaique du concombre et du peanut stunt virus

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Phenomenes d'interference entre souches du virus de la mosaique du concombre (cmv). I- Repartition des antigenes viraux dans le Nicotiana tabacum var xanthi n.c. inocule simultanement ou successivement par deux souches serologiquement differentes

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Relations serologiques entre la capside non degradee et les antigenes solubles de differentes souches du virus de la mosaique du concombre et du peanut stunt virus

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First report of Alfalfa mosaic virus in Pachysandra terminalis in Europe

International audiencePachysandra terminalis (Buxaceae) was introduced from Japan to Europe in 1882. This ornamental plant is grown in northern Europe as a ground cover in shaded sites. Line patterns, more or less necrotic ringspots, and mosaic symptoms on leaves of pachysandra plants have been seen in public gardens in France (Strasbourg, Colmar, Mulhouse, and Nantes) and Germany (Freiburg im Breisgaü). Extracts of plant tissues obtained from these five sites were used for mechanical- and aphid-transmission experiments, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) with antibodies directed toward a tomato strain of Alfalfa mosaic virus (AMV) (from G. Marchoux, INRA, France), and electron microscopy. All inoculations produced symptoms typical for AMV in Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc tobacco, Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Vigna unguiculata, Phaseolus vulgaris, Vicia faba, Pisum sativum, and Ocimum basilicum (2). Moreover, Medicago arborea, a new host for AMV, showed systemic mosaic on leaflets. On these and the original pachysandras, AMV was readily detected by ELISA. After isolation from three to four local lesions on Vigna unguiculata and further multiplication in tobacco, one isolate was purified. Bacilliform particles of three sizes, typical for AMV, were seen by electron microscopy. Transmissions of the strain to ELISA-negative pachysandras was achieved by mechanical inoculations (7 of 20 inoculated plants were ELISA positive) and by the aphid species Myzus persicae and Aphis craccivora (14 of 17 inoculated plants were infected). Symptoms were observed 2 months after inoculation; some of the plants remained symptomless but were AMV positive in ELISA. As early as 1970, similar symptoms were reported in pachysandra in New Jersey, and AMV was isolated from affected plants (1). However, inoculations of healthy pachysandra plants with AMV was not performed. Our results show the need for an AMV indexing protocol in the propagation of pachysandra to control its spread

Dosage immunoenzymatique (elisa) du virus de la mosaique du concombre I-Aspect methodologique

National audienceThe ELISA test (double antibody sandwich type) can be used as a quantitative method of estimating the concentration of cucumber mosaic virus (CMV). Strictly defined experimental conditions had to be observed to obtain acceptable accuracy in the estimations. A study with purified and stabilized preparations of CMV showed much variation in the absorbance values (D.O). for the same antigen concentrat This variation, observed with both MICROELISA plates and PAK cuvettes, restricted the quantitative reliability of the method appreciably. It was possible to remedy these inconveniences partly (I) by eliminating the outer rows of wells, (II) by taking into consideration the differences between two successive recordings of absorbance values (∆ O.D.), and (III) by taking several measurements of each tested sample following a previously established loading scheme. Under these conditions, coefficients of variation were less than 10 per cent for antigen concentrations between 25 and 250 ng/ml. In this concentration range, a good linear relationship (with p = 0.01) existed between ∆ O.D. values and log antigen concentration. Therefore, a regression line fitted to data obtained from dilutions of a " standard " antigen preparation could be used in a comparative method to estimate the antigen content of an unknown sample. One " standard " was enough for each test, as the regression lines obtained in different cuvettes were generally parallel. However, lack of reliability between assays, probably due to variation in operational conditions during substrate hydrolysis, necessitated the incorporation of a " standard " into each assay.Le test immunoenzymatique ELISA (type « sandwich ») peut être utilisé pour le dosage du virus de la mosaïque du concombre (CMV) à condition de se placer dans des conditions expérimentales strictement définies qui sont indispensables si l’on veut obtenir une précision acceptable dans les estimations fournies par la méthode. Une étude réalisée avec des préparations de CMV purifié stabilisé fait en effet apparaître des variations importantes dans les valeurs de densité optique (D.o.) enregistrées pour une même concentration en antigène. Les variations que l’on observe avec les deux types de support étudiés (plaques MICROELISA et cuvettes PAK) sont souvent liées à la position des puits ; elles limitent sensiblement les possibilités de dosage. Il est possible de remédier en partie à ces inconvénients en éliminant des puits situés en bordure, en prenant en considération les différences de densité optique (∆ D.o.) entre deux lectures successives et en procédant, pour chaque extrait analysé, à plusieurs mesures selon un schéma de dépôt préalablement établi (cas des cuvettes PAK). Dans ces conditions, les coefficients de variation sont inférieurs à 10 p. 100 pour des teneurs en antigène comprises entre 250 et 25 ng/ml. Dans cette gamme de concentrations, il existe une bonne corrélation linéaire (au seuil 0,01) entre les valeurs de ∆ D.o. et les log. des concentrations en virus. Ainsi, une droite de régression, établie à partir des ∆ D.o. correspondant à 4 dilutions d’une préparation antigénique « standard » permet, par comparaison, d’estimer la teneur en virus d’un extrait inconnu. Il suffit d’incorporer un seul « standard » dans chaque essai, les droites de régression établies dans plusieurs cuvettes étant en général parallèles. En revanche, la mauvaise reproductibilité de la méthode, due vraisemblablement à des variations dans les conditions d’hydrolyse du substrat, nécessite de disposer d’un « standard » dans chaque essai. En raison de l’instabilité du virus de la mosaïque du concombre, la préparation « standard utilisée dans plusieurs essais successifs doit obligatoirement être stabilisée par le formaldéhyde. Les conséquences de cette stabilisation sur le comportement du virus en ELISA sont discutées. En dépit de ces imperfections, le test immunoenzymatique ELISA apparaît comme la méthode actuellement la mieux adaptée pour le dosage rapide du virus de la mosaïque du concombre dans le cadre de l’analyse systématique d’un grand nombre d’échantillons

First report of cucumber mosaic virus in Teucrium fruticans

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Indexages biologique et immunoenzymatique (ELISA) pour la production d'oeillets indemnes de virus de la marbrure (CarMV)

National audienceThe bioassay on Chenopodium quinoa is the best method for detecting mottle virus in infected carnations. But, despite its high sensitivity, this method is difficult to use in the commercial production of « virus-tested» carnation cuttings, necessitating numerous routine tests, and could usefully be replaced by an imymuno-enzmatic assay (ELISA) which is more rapid and open to automatization. A comparative study of these two methods shows that, theoretically, the Emsn technique is able to detect down to 5 to 1 ng of virus per ml and, thus in practice, all the « normal » infections in carnations. Nevertheless, the bioassay remains 50 to 500 times more sensitive than Eusw and is the only means of revealing the infections attributed to the so-called « attenuated form » of the virus. Nearly 10 000 ELISA tests carried out during the past two years at all stages of the production of carnation cuttings have made it possible to follow the reappearance of infections by the « attenuated form » of CarMV, which were hidden during the early stages of multiplication. This has led to an appreciation of the extent of these infections in the crop and to the development of a control scheme for their elimination. While the bioassay always appears absolutely essential to ensure the best sanitary conditions possible in the first year of multiplication, the ELISA technique can be used efficiently for several purposes : for rogueing the most infected plantlets as early as the « in vitro » stage, for reducing the number of biological tests on Chenopodium, and, finally, for maintaining a low disease level till the last steps of multiplication, the moment when large scale biological indexing cannot be considered.L’indexage biologique sur Chenopodium quinoa est la méthode la plus apte à détecter le virus de la marbrure dans les oeillets infectés. En dépit de sa grande sensibilité, elle s’avère néanmoins difficile à utiliser dans le cadre d’une production commerciale de boutures sélectionnées, nécessitant de très nombreux contrôles de routine et serait avantageusement remplacée par un indexage immunoenzymatique ELISA beaucoup plus rapide et automatisable. Une étude comparative de ces deux méthodes montre que si le test ELISA peut détecter théoriquement 5 à 1 ng/ml de virus et, en pratique, toutes les infections « normales » chez l’oeillet, le test biologique reste de 50 à 500 fois plus sensible et le seul capable de mettre en évidence les infections occasionnées par la forme dite « atténuée » du virus. Au cours des deux dernières années, près de 10 000 tests ELISA pratiqués aux différents stades de la production de boutures d’oeillet, ont permis de suivre la résurgence des infections par la forme « atténuée » du virus, masquées en début de multiplication, d’en mesurer l’importance et de définir les modalités de contrôles nécessaires à leur élimination. Si le test sur chénopode apparaît toujours indispensable pour s’assurer du meilleur état sanitaire possible en 1er année de culture, le test ELISA intervient efficacement à plusieurs niveaux : en permettant une épuration précoce dès le stade « in vitro » des plantules les plus infectées, en allégeant par la suite le test biologique et en contrôlant enfin le maintien d’un état sanitaire satisfaisant jusqu’aux derniers stades de la multiplication, alors qu’un indexage biologique à grande échelle ne saurait être envisagé

Indexages biologique et immunoenzymatique (ELISA) pour la production d'oeillets indemnes de virus de la marbrure (CarMV)

L’indexage biologique sur Chenopodium quinoa est la méthode la plus apte à détecter le virus de la marbrure dans les oeillets infectés. En dépit de sa grande sensibilité, elle s’avère néanmoins difficile à utiliser dans le cadre d’une production commerciale de boutures sélectionnées, nécessitant de très nombreux contrôles de routine et serait avantageusement remplacée par un indexage immunoenzymatique ELISA beaucoup plus rapide et automatisable. Une étude comparative de ces deux méthodes montre que si le test ELISA peut détecter théoriquement 5 à 1 ng/ml de virus et, en pratique, toutes les infections « normales » chez l’oeillet, le test biologique reste de 50 à 500 fois plus sensible et le seul capable de mettre en évidence les infections occasionnées par la forme dite « atténuée » du virus. Au cours des deux dernières années, près de 10 000 tests ELISA pratiqués aux différents stades de la production de boutures d’oeillet, ont permis de suivre la résurgence des infections par la forme « atténuée » du virus, masquées en début de multiplication, d’en mesurer l’importance et de définir les modalités de contrôles nécessaires à leur élimination. Si le test sur chénopode apparaît toujours indispensable pour s’assurer du meilleur état sanitaire possible en 1er année de culture, le test ELISA intervient efficacement à plusieurs niveaux : en permettant une épuration précoce dès le stade « in vitro » des plantules les plus infectées, en allégeant par la suite le test biologique et en contrôlant enfin le maintien d’un état sanitaire satisfaisant jusqu’aux derniers stades de la multiplication, alors qu’un indexage biologique à grande échelle ne saurait être envisagé.The bioassay on Chenopodium quinoa is the best method for detecting mottle virus in infected carnations. But, despite its high sensitivity, this method is difficult to use in the commercial production of « virus-tested» carnation cuttings, necessitating numerous routine tests, and could usefully be replaced by an imymuno-enzmatic assay (ELISA) which is more rapid and open to automatization. A comparative study of these two methods shows that, theoretically, the Emsn technique is able to detect down to 5 to 1 ng of virus per ml and, thus in practice, all the « normal » infections in carnations. Nevertheless, the bioassay remains 50 to 500 times more sensitive than Eusw and is the only means of revealing the infections attributed to the so-called « attenuated form » of the virus. Nearly 10 000 ELISA tests carried out during the past two years at all stages of the production of carnation cuttings have made it possible to follow the reappearance of infections by the « attenuated form » of CarMV, which were hidden during the early stages of multiplication. This has led to an appreciation of the extent of these infections in the crop and to the development of a control scheme for their elimination. While the bioassay always appears absolutely essential to ensure the best sanitary conditions possible in the first year of multiplication, the ELISA technique can be used efficiently for several purposes : for rogueing the most infected plantlets as early as the « in vitro » stage, for reducing the number of biological tests on Chenopodium, and, finally, for maintaining a low disease level till the last steps of multiplication, the moment when large scale biological indexing cannot be considered