Transcriptome analysis of amyloodinium ocellatum tomonts revealed basic information on the major potential virulence factors

The ectoparasite protozoan Amyloodinium ocellatum (AO) is the etiological agent of amyloodiniosis in European seabass (Dicentrarchus labrax) (ESB). There is a lack of information about basic molecular data on AO biology and its interaction with the host. Therefore, de novo transcriptome sequencing of AO tomonts was performed. AO trophonts were detached from infested ESB gills, and quickly becoming early tomonts were purified by Percoll\uae density gradient. Tomont total RNA was processed and quality was assessed immediately. cDNA libraries were constructed using TruSeq\uae Stranded mRNA kit and sequenced using Illumina sequencer. CLC assembly was used to generate the Transcriptome assembly of AO tomonts. Out of 48,188 contigs, 56.12% belong to dinophyceae wherein Symbiodinium microadriaticum had 94.61% similarity among dinophyceae. Functional annotations of contigs indicated that 12,677 had associated GO term, 9005 with KEGG term. The contigs belonging to dinophyceae resulted in the detection of several peptidases. A BLAST search for known virulent factors from the virulence database resulted in hits to Rab proteins, AP120, Ribosomal phosphoprotein, Heat-shock protein70, Casein kinases, Plasmepsin IV, and Brucipain. Hsp70 and casein kinase II alpha were characterized in-silico. Altogether, these results provide a reference database in understanding AO molecular biology, aiding to the development of novel diagnostics and future vaccines

Understanding the Pathogenesis of Red Mark Syndrome in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) through an Integrated Morphological and Molecular Approach

Red mark syndrome (RMS) is a widespread skin disorder of rainbow trout in freshwater aquaculture, believed to be caused by a Midichloria-like organism (MLO). Here, we aimed to study the pathologic mechanisms at the origin of RMS by analyzing field samples from a recent outbreak through gene expression, MLO PCR, quantitative PCR, and a histopathological scoring system proposed for RMS lesions. Statistical analyses included a One-Way Analysis of Variance (ANOVA) with a Dunnett’s multiple comparisons test to assess differences among gene expression groups and a nonparametric Spearman correlation between various categories of skin lesions and PCR results. In short, the results confirmed the presence of a high quantity of 16S gene copy numbers of Midichloria-like organisms in diseased skin tissues. However, the number of Midichloria-like organisms detected was not correlated to the degree of severity of skin disease. Midichloria-like organism DNA was found in the spleen and head kidney. The spleen showed pathologic changes mainly of hyperplastic type, reflecting its direct involvement during infection. The most severe skin lesions were characterized by a high level of inflammatory cytokines sustaining and modulating the severe inflammatory process. IL-1 β, IL-6, IL-10, MHC-II, and TCR were upregulated in severe skin lesions, while IL-10 was highly expressed in moderate to severe ones. In the moderate form, the response was driven to produce immunoglobulins, which appeared crucial in controlling the skin disease’s severity. Altogether our results illustrated a complex immune interaction between the host and Midichloria-like organism

New data on wild grey mullet (mugil cephalus linnaeus, 1758) myxosporean (myxobolus episquamalis egusa et al., 1990) in the black sea

Flathead grey mullet, Mugil cephalus, with mass whitish cystlike plasmodia on their scales were collected at Kerchensky preglass of the Black Sea in 2015. The prevalence of infected fish varied from 15% in spring, reached 100% in summer, and declined to 2.5% in autumn. No fish mortality was detected. The spores were oval in frontal view, tapering to a blunt apex. Two unequal polar capsules were pyriform and extended over the anterior half of spore. Spores were 8.2\ub10.03 \u3bcm (7.9-8.4) long, 5.9\ub10.23 \u3bcm (5.2-7.3) wide, and 4.4\ub10.17 \u3bcm (4.0-4.7) thick. Two pyriform and unequal polar capsules were observed (4.0\ub10.07 \u3bcm (3.3-4.5) long, and 1.5\ub10.24 \u3bcm (1.1-1.8) wide). The investigation of nucleotide sequences of the 18S rDNA gene of the myxosporean spores from scales with universal primer A (5\u2032-ACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3\u2032) and B (5\u2032-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3\u2032) showed 100% identity with episquamalis, and 99 % with M. bizerti, M. ichkeulensis, M. spinacurvata and Myxobolus sp. previously detected in mullets. The results obtained from the present study reveal that M. episquamalis, found on the scales of M. cephalus from Kerchensky preglass of the Black Sea, is new record for Russian waters

Expression of infection-related immune response in European sea bass (Dicentrarchus labrax) during a natural outbreak from a unique dinoflagellate Amyloodinium ocellatum

In the Mediterranean area, amyloodiniosis represents a major hindrance for marine aquaculture, causing high mortalities in lagoon-type based rearing sites during warm seasons. Amyloodinium ocellatum (AO) is the most common and important dinoflagellate parasitizing fish, and is one of the few fish parasites that can infest several fish species living within its ecological range. In the present study, A. ocellatum was recorded and collected from infected European sea bass (Dicentrarchus labrax) during a summer 2017 outbreak in north east Italy. Histological observation of infected ESB gill samples emphasized the presence of round or pear-shaped trophonts anchored to the oro-pharingeal cavity. Molecular analysis for small subunit (SSU) rDNA of A. ocellatum from gill genomic DNA amplified consistently and yielded 248 bp specific amplicon of A. ocellatum, that was also confirmed using sequencing and NCBI Blast analysis. Histological sections of ESB gill samples were addressed to immunohistochemical procedure for the labelling of ESB igm, inos, tlr2, tlr4, pcna and cytokeratin. Infected gills resulted positive for igm, inos, pcna and cytokeratin but negative to tlr-2 and tlr-4. Furthermore, ESB immune related gene response (innate immunity, adaptive immunity, and stress) in the course of A. ocellatum infection using quantitative polymerase chain reaction (qpcr) for infected gills and head kidney was analysed. Among the twenty three immune related gene molecules tested, cc1, il-8, il-10, hep, cox-2, cla, cat, casp9, and igt were significantly expressed in diseased fish. Altogether, these data on parasite identification and expression of host immune-related genes will allow for a better understanding of immune response in European sea bass against A. ocellatum and could promote the development of effective control measures

Efficacy of a formalin-inactivated Lactococcus garvieae vaccine in farmed grey mullet (Mugil cephalus)

Lactococcosis [Lactococcus garvieae (LG)] is one of the most prevalent bacterial diseases affecting grey mullet (Mugil cephalus) aquaculture. Therefore, the present research evaluated the efficacy of formalin-killed LG vaccine with an oil-based adjuvant in grey mullet under laboratory and field trials. The laboratory evaluation for LG vaccine and its cross-protection upon challenge in grey mullet found that single-dose immunization of formalin-killed LG with adjuvant resulted in 91.4% and 100% relative per cent survival (RPS) when challenged with homologous and heterologous strains. The levels of specific antibody titre and lysozyme activity increased significantly in the vaccinated group. Immune gene expression at 24\ua0hr after challenge showed an increase in levels of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines. A parallel field trial experiment was conducted to investigate the long-term effectiveness of the LG vaccine. Results demonstrated that at one month and three months post-immunization with heterologous strain, 100% RPS was recorded in the vaccinated group. The findings suggested that the formalin-inactivated LG vaccine strain (S3) protected grey mullet against LG infection for a period of three months

Effetti in vitro di 16 composti di origine vegetale sulla motilit\ue0 di dinospore di Amyloodinium ocellatum.

L\u2019amyloodiniosi, ovvero l\u2019infezione sostenuta dal protozoo ectoparassita Amyloodinium ocellatum, \ue8 un serio problema per l\u2019acquacoltura semi-intensiva nel bacino Mediterraneo, specialmente nei mesi pi\uf9 caldi quando si possono registrare tassi di mortalit\ue0 anche del 100%. Nonostante questa infezione sia responsabile di ingenti perdite produttive, al momento non esistono presidi terapeutici che al contempo siano efficaci e autorizzati dalla legislazione nazionale e europea. Il solfato di rame (composto di prima scelta) e la formaldeide sono utilizzati per il controllo dell\u2019infezione, in quanto efficaci sulle dinospore (stadio infettante), tuttavia essi non sono attualmente registrati in Italia per l\u2019uso farmacologico. Allo scopo di ridurre l\u2019impatto che queste sostanze possono avere sull\u2019ambiente e sulla salute animale, nell\u2019ambito del progetto Horizon2020 ParaFishControl sono previste indagini mirate alla ricerca di terapie eco-sostenibili e attente al benessere animale. In quest\u2019ottica, il nostro gruppo di ricerca sta valutando l\u2019effetto in vitro di un pannello di 16 composti di origine vegetale sulla motilit\ue0 di dinospore di A. ocellatum. Le dinospore, originatesi in laboratorio da tomonti prelevati da un episodio spontaneo di malattia, sono state contate con camera conta cellule (S50 Sedgewick Rafter Cell, Pyser \u2013 SGI), quindi portate alla concentrazione approssimativa di 5200 dinospore/ml in terreno di coltura HBSS/IO2 (1:1). Successivamente, esse sono state seminate in micropiastra da 96 pozzetti (100 \ub5l/pozzetto) in cui precedentemente erano state allestite diluizioni seriali delle 16 sostanze oggetto di studio: 2I,4I \u2013 diidrossicalcone; 7 \u2013 idrossiflavone; acido rosmarinico; artemisinina; canfora (1R); diallil solfuro; esculetina; eucaliptolo; garlicina 80%; harmalolo idrocloruro diidrato; palmatina cloruro; piperina; resveratrolo; sclareolide; tomatina e umbelliferone. Ciascuna concentrazione di composto (6,25 \ub5g/ml \u2013 50 \ub5g/ml, 100 \ub5l/pozzetto) \ue8 stata saggiata in duplicato. Come controllo inibente positivo \ue8 stato utilizzato il solfato di rame (0,25 \u2013 1 \ub5g/ml), mentre il controllo negativo consisteva in dinospore incubate in solo terreno di coltura. Mediante camera per sedimenti urinari (Vacutest Kima precision cell) sono state osservate al microscopio ottico aliquote (50\ub5l/pozzetto) prelevate dalla piastra dopo 1, 6 e 24 ore di incubazione a temperatura ambiente, al fine di contare le dinospore non motili. Quindi \ue8 stata calcolata la percentuale di dinospore ancora natanti per ciascuna concentrazione di composto e ai diversi tempi di incubazione. Fra le sostanze saggiate, la tomatina e il 2I,4I \u2013 diidrossicalcone hanno ridotto notevolmente e con effetto dose-dipendente il moto delle dinospore. Per questo motivo i due composti sono stati ulteriormente saggiati in un range pi\uf9 ampio di concentrazioni (0,39 \u2013 50 \ub5g/ml). La tomatina \ue8 risultata in grado di arrestare la motilit\ue0 del 100% sin dalla prima ora di incubazione fino alla concentrazione di 6,25 \ub5g/ml. Invece, alle concentrazioni minori (0,39 \u2013 3,13 \ub5g/ml) pi\uf9 dell\u201980% dei protozoi era attivo anche dopo 24 ore di incubazione. Il flavonoide 2I,4I \u2013 diidrossicalcone si \ue8 rivelato inibitore solo alle concentrazioni pi\uf9 elevate (50 e 25 \ub5g/ml) nella prima ora d\u2019incubazione, mentre la sua efficacia \ue8 risultata limitata a concentrazioni 64 12,5 \ub5g/ml e in generale dopo 6 ore di incubazione. Le altre sostanze non hanno avuto alcun effetto rilevante sulla motilit\ue0 dei protozoi, mentre il solfato di rame si \ue8 dimostrato efficace alla concentrazione di 1 \ub5g/ml nelle prime ore di incubazione. Ulteriori studi in vitro sono necessari per approfondire le conoscenze sull\u2019attivit\ue0 di queste molecole e per selezionare in vivo dosi di tomatina e 2I,4I \u2013 diidrossicalcone non tossiche per i pesci

IMMUNE-GENES EXPRESSION ANALYSIS DURING TIME COURSE AND RECOVERY PROCESS INDICATES THE MECHANISM FOR INNATE IMMUNE RESPONSE AND REPAIR AFTER AMYLOODINIOSISIN EUROPEAN SEA BASS (DICENTRARCHUS LABRAX)

Currently, there are no effective preventive measures to control Amyloodinium ocellatum(AO) dinospores/trophonts infection in Europeansea bass (ESB). A vaccine against AO is not available because specific immunogenic antigens have not been identified yet. Moreover, there is a lack of information about basic molecular mechanisms of host immune responses following AO infection.In order to investigate the innate immune response and repair mechanism during the recovery from amyloodiniosis, 26 ESB (mean weight 14g) per tank in triplicate were bath challenged for 2h with AO (3.5 7106/tank; 70 dinospores/ml) under controlled conditions (26-28\ub0Cand 34\u2030 salinity). As a control group (non-infected), 26 ESB per tank in triplicate were also used. The time-course of infection was determined by fresh microscopical examination of gills and histopathological evaluations. After 2 hour, fish were already infected, and at 2 days post infection (dpi) the AO trophonts burden was discrete with light clinical symptoms. During the infection, the maximum AO burden was observed at 10-12 dpi, thereafter fish started to recover even if positive to amyloodiniosis. Throughout this period the total mortality was 18 %. In control group, fish were not infected and no mortality was registered. Expression changes of innate immune genes in gills and head kidney at 2, 3, 5, 7 and 23 dpi were analysed using real-time PCR. Theresults indicated that the expression of cytokines (CC1, IL-8) and antimicrobial peptide (Hep) were strongly stimulatedand reached the peak at 5 dpi in the early infection stage, followed by a gradual reduction in the recovery stage (23 dpi), during which the levels were even lower at 23 dpi. Noticeably, the immunoglobulin (IgM) expressions were higher at 23 dpi compared to 7 dpi. These results indicated the strong correlation between igm, hepcidin and chemokine expression level. The hepcidin and chemokine CC1 might play a role in the inflammatory response during early and recovery stages. Altogether, our observations represent the first step towards understanding the molecular mechanism of theamyloodiniosispathogenesisin European sea bass

PARAMETRI IMMUNITARI DELLA TROTA IRIDEA (O. MYKISS) QUALI INDICATORI DI RESISTENZA GENETICA ALLA LATTOCOCCOSI

Le strategie mirate al controllo delle malattie batteriche nei pesci prevedono l\u2019utilizzo di vaccini autologhi o commerciali e l\u2019eventuale trattamento terapeutico. Tuttavia, la vaccinazione spesso non viene effettuata in quanto troppo costosa o per la ridotta efficacia che gli allevatori attribuiscono ai vaccini disponibili. Dall\u2019altro lato, l\u2019utilizzo di antibiotici \ue8 ampiamente criticato in quanto determina la dispersione di residui chimici nell\u2019ambiente, con conseguente rischio di insorgenza di ceppi antibiotico resistenti. Risulta pertanto utile ricercare forme alternative e/o complementari di controllo delle malattie, tra cui l\u2019individuazione di fattori genetici intrinseci che consentano di selezionare ceppi di pesci resistenti.Il presente studio illustra i risultati ottenuti nel corso di un'infezione sperimentale sub-clinica per immersione con Lactococcus garvieaein gruppi di trote iridee selezionate su base genetica come resistenti e suscettibili alla malattia in esame. L\u2019intento era quello di analizzare il profilo di alcuni parametri di immunit\ue0 innata e adattativa ritenuti rilevanti per definire le attitudini difensive (Magnadottir, 2010; Das & Sahoo, 2014) dei due stock ittici, sia in condizioni normali (pre-challenge) sia in seguito ad uno stimolo di tipo infettivo prodotto dall\u2019interazione con un batterio patogeno per la specie stessa.La condizione immunologica di un organismo pu\uf2 suggerire, infatti, la presenza di specifici tratti genetici che lo rendono resistente nei confronti di un agente biologico. Con questa finalit\ue0 26 soggetti resistenti e 26 suscettibili sono stati sottoposti a challenge come descritto nell\u2019abstract presentato da Colussi et al., (Convegno SIPI 2018). Nell\u2019ambito dello stesso protocollo sperimentale 10 soggetti resistenti e 10 suscettibili sono stati utilizzati come controllo negativo. I prelievi di campioni biologici (siero, sangue, muco, rene anteriore) condotti al temine del challenge nei soggetti di controllo (suscettibili e resistenti) e nei soggetti infettati (suscettibili e resistenti) sono stati analizzati avvalendosi di metodiche immunologiche classiche (attivit\ue0 del lisozima in siero e muco; leucogramma in sangue; burst ossidativo dei leucociti in rene anteriore; livello di IgM specifiche per L. garvieae in siero) e mediante uno studio di espressione genica nel rene anteriore con qPCR (IL-1\u3b2, IL-10, TNF-\u3b1, IL-8, IgT, Tlr5, \u3b2-actin, IL-6, IgM, MHC-I, MHC-II, TCR-\u3b2).Considerando i meccanismi di risposta aspecifica, l\u2019attivit\ue0 del lisozima nel siero e nel muco \ue8 risultata pi\uf9elevata nei soggetti appartenenti allo stock ittico resistente rispetto a quello suscettibile, gi\ue0 in fase di pre-infezione, e tale attivit\ue0 \ue8 incrementata in modo significativo in entrambi gli stock genetici in seguito all\u2019esposizione a L. garvieae.Per quanto riguarda la risposta cellulare, l\u2019attivit\ue0 di burst ossidativo dei leucociti \ue8 risultata maggiore nei soggetti resistenti rispetto a quelli suscettibili, soprattutto in fase di pre-infezione. Inoltre, \ue8 stata rilevata una maggiore espressione di IL-1\u3b2eIL-10 nei soggetti suscettibili sottoposti ad infezione, rispetto alle trote resistenti sottoposte allo stesso trattamento. Nella presente ricerca entrambi i gruppi sperimentali (suscettibile e resistente) hanno mostrato un livello elevato di IgM reattive nei confronti di L. garvieae,ma ulteriori indagini al riguardo sono necessarie per chiarire il possibile impiego di questo parametro per la selezione di stock di trota iridea resistenti alle malattie.Nei soggetti resistenti l\u2019infezione ha stimolato una maggiore espressione dei geni codificanti per IgM e MHC-II rispetto a quanto osservato nei soggetti suscettibili, suggerendo l\u2019attivazione di meccanismi quali la presentazione dell\u2019antigene e la sintesi di anticorpi utili alla protezione delle trota dal patogeno L. garvieae.Sulla base di queste osservazioni preliminari emergono spunti interessanti per proseguire lo studio immunologico di diverse linee genetiche di trota iridea, finalizzato allo screening di popolazioni resistenti da dedicare all\u2019allevamento intensivo in contesti ambientali suscettibili alla lattococcosi

PRIMA INFEZIONE SPERIMENTALE DI TROTA IRIDEA (ONCORHYNCHUS MYKISS) CON LACTOCOCCUS GARVIEAE PER IMMERSIONE-DILUIZIONE

Nell'ambito dell'Unione Europea, l'Italia detiene il primato per l'allevamento della trota iridea. Tra le problematiche maggiormente rilevanti negli allevamenti intensivi d'acquacoltura vi sono le malattie infettive; la lattococcosi, in particolare, rappresenta la malattia batterica pi\uf9 grave della troticoltura italiana, fonte di ingenti perdite economiche. Le strategie di controllo tradizionali si basano sull\u2019utilizzo di vaccini autologhi o commerciali e sul trattamento terapeutico; in entrambi i casi vi sono grossi limiti dovuti alla ridotta efficacia dei vaccini e alla possibilit\ue0 di immissione di antibiotici nell\u2019ambiente, con accresciuto rischio di insorgenza di ceppi antibiotico resistenti. Da ci\uf2 l\u2019esigenza di implementare forme alternative e/o complementari di controllo della malattia basate sullo sfruttamento di fattori intrinseci presenti nella genetica dell\u2019ospite trota. Un gene risultato particolarmente promettente \ue8 stato l'MHCIIB (Colussi et al.2015). A tal fine sono stati selezionati su base genetica 26 soggetti suscettibili e 26 soggetti di trota iridea (Oncorhyncus mykiss) resistenti alla lattococcosi da sottoporre a challenge per per immersione-diluizione e ulteriori 10 soggetti per ciascun gruppo sono stati utilizzati come controllo. La prova \ue8 stata eseguita presso l'acquario sperimentale dell'IZS delle Venezie. Le trote sono state divise in vasche indipendenti e sottoposte a challenge per immersione ad una temperatura di 17 \ub0C, per 3 ore, con una soluzione di Lactococcus garvieaead una concentrazione finale di 1,6 x 103 CFU/ml. Dopo 4 giorni dal challenge, non rilevando sintomatologia nei soggetti infettati \ue8 stato effettuato un secondo challenge per immersione con le stesse modalit\ue0 del primo, ma aumentando la concentrazione del patogeno a 1,6 x 105CFU/ml. Non \ue8 stata osservata alcuna sintomatologia fino al nono giorno post-infezione. Un singolo soggetto appartenente al gruppo dei suscettibili sottoposti ad infezione ha mostrato sintomatologia tipica con comparsa di ipermelanosi, esoftalmo, splenomegalia e caratteristiche emorragie degli organi interni. Non \ue8 stato registrato alcun decesso al termine dell\u2019end-point sperimentale e tutti i soggetti sopravvissuti sono stati sottoposti ad eutanasia come previsto dal protocollo sperimentale. Gli esami colturali effettuati sono risultati tutti negativi tranne per il colturale effettuato da sangue e da rene del soggetto sintomatico risultato positivo per Lactococcus garvieae. Sono stati valutati differenti parametri immunitari umorali e cellulari nelle trote resistenti e suscettibili in fase di pre e post-infezione (abstract di Volpatti et al. SIPI 2018).L'assenza di mortalit\ue0 post-infezione e la presenza di sintomatologia in un solo soggetto suscettibile pu\uf2 essere ascrivibile a diverse criticit\ue0 che caratterizzano gli esperimenti di challenge: primo tra tutti la dose infettante; la patogenicit\ue0 del ceppo utilizzato; il tempo di interazione tra ospite e patogeno; la storia immunitaria dei soggetti sottoposti a challenge; i parametri ambientali, quali la temperatura; la durata del periodo di osservazione post-infezione. Sebbene non sia possibile sapere quale parametro possa aver maggiormente influito sulla mancata registrazione di mortalit\ue0, dalla presenza di un soggetto sintomatico e dalle differenze significative registrate in relazione ai parametri immunitari indagati sulle due linee, si pu\uf2 ipotizzare di aver ottenuto un'infezione in forma sub-clinica che, seprotratta oltre l'end-point sperimentale, si sarebbe propagata ad altri soggetti suscettibili e avrebbe indotto mortalit\ue0 nei soggetti sintomatici. Sarebbe pertanto auspicabile utilizzare, in studi futuri, un duplice approccio di selezione dei soggetti resistenti basato sull'utilizzo di marker sia molecolari, tra cui l'MHCII, sia immunologici