Upregulation of the Mevalonate Pathway through EWSR1-FLI1/EGR2 Regulatory Axis Confers Ewing Cells Exquisite Sensitivity to Statins

Ewing sarcoma (EwS) is an aggressive primary bone cancer in children and young adults characterized by oncogenic fusions between genes encoding FET-RNA-binding proteins and ETS transcription factors, the most frequent fusion being EWSR1-FLI1. We show that EGR2, an Ewing-susceptibility gene and an essential direct target of EWSR1-FLI1, directly regulates the transcription of genes encoding key enzymes of the mevalonate (MVA) pathway. Consequently, Ewing sarcoma is one of the tumors that expresses the highest levels of mevalonate pathway genes. Moreover, genome-wide screens indicate that MVA pathway genes constitute major dependencies of Ewing cells. Accordingly, the statin inhibitors of HMG-CoA-reductase, a rate-limiting enzyme of the MVA pathway, demonstrate cytotoxicity in EwS. Statins induce increased ROS and lipid peroxidation levels, as well as decreased membrane localization of prenylated proteins, such as small GTP proteins. These metabolic effects lead to an alteration in the dynamics of S-phase progression and to apoptosis. Statin-induced effects can be rescued by downstream products of the MVA pathway. Finally, we further show that statins impair tumor growth in different Ewing PDX models. Altogether, the data show that statins, which are off-patent, well-tolerated, and inexpensive compounds, should be strongly considered in the therapeutic arsenal against this deadly childhood disease. Keywords: Ewing sarcoma; MVA pathway; new therapeutic strategy; statin

EWSR1-FLI1 : cible thérapeutique dans le sarcome d'Ewing

Ewing's sarcoma, the second most common pediatric bone tumor, is an aggressive and metastatic tumor. In 85% of cases, this tumor is characterized by a t(11;22)(q24;q12) translocation encoding for the EWSR1-FLI1 fusion protein. EWSR1-FLI1 is an aberrant transcription factor, characterized as the oncogene driver, which modulates the expression of genes involved in proliferation, migration and apoptosis. Currently, patient healthcare use surgery associated with aggressive poly chemotherapy and radiotherapy. These treatments are very effective for the localized forms, but alter their quality of life, and have few effects on metastatic disease. In this way, it's necessary to develop new targeted therapies in order to have a better patient care. In the literature, targeted therapies are focus on the partner and signaling pathways regulated by EWSR1-FLI1. However, no targeted therapies have been found to act specifically on EWSR1-FLI1 expression beside some studies on the regulation of EWSR1-FLI1 stability. Thus, in the laboratory, we are interested in the identification of families acting on EWSR1-FLI1 expression. Thanks to a high throughput screening, we were able to identify 3 families of compounds of interest in Ewing's sarcoma, which two of them act on the stability of EWSR1-FLI1. The first family are the statins, compounds allowing the inhibition of HMGCR, one of the two limiting enzymes of the mevalonate pathway. During my PhD, we showed that the mevalonate pathway is essential in Ewing's sarcoma. Furthermore, it is regulated by EWSR1-FLI1 via the regulation of EGR2 susceptibility gene. We have also shown that Ewing cell lines and patient-derived xenografts show increased sensitivity to statins compared to other cancer cell lines. Our studies suggest that statins induce inhibition of the mevalonate pathway leading to a decrease of small GTPase protein prenylation, an increase of ROS levels and increase of lipid peroxidation. The deregulation of these molecular mechanisms result in a decrease in cell proliferation via a replication impairment, an increase of apoptosis. Finally, we have shown by in vivo studies that statins induce slow-down of tumor growth of different Ewing tumors PDX. The second and third families are the inhibitors of the ubiquitin-proteasome degradation Complex and the HDAC inhibitors (HDACi) characterized as stabilizers and destabilizers of EWSR1-FLI1, respectively. During my thesis, I was interested in HDACi that are able to destabilize EWSR1-FLI1. We showed that HDACi act on EWSR1-FLI1 by transcriptional and post-translational regulation and this effect is cell line dependent. On the other hand, we showed that EWSR1-FLI1 is acetylated in two Ewing cell lines and that this acetylation occurs mainly on K298. In parallel to this screen, we have shown that oxidative stress acts on the stability of EWSR1-FLI1 make, a promising target for the development of new therapies.Le sarcome d'Ewing, seconde tumeur osseuse pédiatrique, est une tumeur agressive et métastatique. Dans 85% des cas, cette tumeur est caractérisée par la translocation chromosomique t(11 ;22)(q24 ;q12) conduisant à l'expression de la protéine de fusion EWSR1-FLI1. EWSR1-FLI1 est un facteur de transcription aberrant considéré comme l'oncogène «driver» de la tumeur permettant de moduler l'expression de gènes spécifiques impliqués dans la prolifération, la migration et l'apoptose. La prise en charge des patients à ce jour associe de la chirurgie et de la chimiothérapie à forte dose, à de la radiothérapie. Ces traitements sont très efficaces sur les formes localisées mais n'ont que très peu d'effet lorsque le patient présente des métastases. C'est pourquoi, il est nécessaire de développer de nouvelles thérapies ciblées pour avoir une meilleure prise en charge des patients. Les thérapies ciblées développées actuellement s'intéressent aux partenaires et aux voies de signalisations régulées par EWSR1-FLI1. Actuellement, hormis des études sur la régulation de la stabilité de EWSR1-FLI1, aucune thérapie ciblée n'agit spécifiquement sur l'expression de EWSR1-FLI1. Au sein du laboratoire, nous nous sommes intéressés à l'identification de composés agissant sur la stabilité de EWSR1-FLI1 à l'aide d'une lignée d'Ewing générée par la méthode de génome « editing » CRISPR-Cas9 exprimant la protéine EWSR1-FLI1 fusionnée à une protéine fluorescente. Le crible a été effectué sur la plateforme Biophenics de l'institut Curie à l'aide d'une chimiothèque de médicaments approuvés par la FDA et d'une banque incluant des inhibiteurs impliqués dans les mécanismes de régulations épigénétiques, dans les modifications post-traductionnelles et dans le complexe de dégradation protéique ubiquitine-protéasome. A partir de la première banque de composés approuvés par la FDA, nous avons identifié les statines comme une famille de composés cytotoxiques pour la tumeur d'Ewing. Nous avons pu montrer que les lignées cellulaires d'Ewing et les cellules issues de tumeurs xénogreffées dérivées de patients (PDX) ont une sensibilité accrue aux statines comparées à d'autres lignées cancéreuses. Les statines sont une famille de composés inhibant l'enzyme HMGCR, une des deux enzymes limitantes de la voie du mévalonate. Nous avons pu montrer que la voie du mévalonate est essentielle dans le sarcome d'Ewing et l'expression de 4 enzymes clés de cette voie métabolite dont l'enzyme HMGCR est régulée par EWSR1-FLI1 via EGR2, gène de susceptibilité du sarcome d'Ewing. Nos études montrent que les statines, en inhibant la voie du mévalonate, induisent une augmentation du niveau des ROS et de la peroxydation des lipides ainsi qu'une diminution de la prénylation des petites protéines G. La dérégulation de ces mécanismes moléculaires conduit à une diminution de la prolifération cellulaire caractérisée par un ralentissement de la vitesse de réplication et à une augmentation de l'apoptose. De plus, nous avons montré par des études in vivo que les statines ralentissaient la croissance de différents PDX issues de tumeurs d'Ewing. A partir de la deuxième banque, nous avons identifié que les inhibiteurs du complexe de dégradation ubiquitine-protéasome et des HDAC (HDACi) agissent respectivement comme des stabilisateurs et des déstabilisateurs de EWSR1-FLI1. Durant ma thèse, je me suis intéressé au rôle des HDACi sur l'expression de EWSR1-FLI1. Nous avons pu montrer un effet transcriptionnel et post-traductionnel des HDACi sur EWSR1-FLI1 suivant les lignées d'Ewing utilisées. Nous avons montré également que la protéine EWSR1-FLI1 est acétylée dans sa partie FLI1 au niveau du résidu lysine K298. Son rôle sur la stabilité de la protéine EWSR1-FLI1 est en cours d'étude. En parallèle de ce crible, nous avons montré, que le stress oxydatif agissait sur la stabilité de EWSR1-FLI1 faisant une cible prometteuse pour développer de nouvelles thérapies

EWSR1-FLI1 : cible thérapeutique dans le sarcome d'Ewing

Ewing's sarcoma, the second most common pediatric bone tumor, is an aggressive and metastatic tumor. In 85% of cases, this tumor is characterized by a t(11;22)(q24;q12) translocation encoding for the EWSR1-FLI1 fusion protein. EWSR1-FLI1 is an aberrant transcription factor, characterized as the oncogene driver, which modulates the expression of genes involved in proliferation, migration and apoptosis. Currently, patient healthcare use surgery associated with aggressive poly chemotherapy and radiotherapy. These treatments are very effective for the localized forms, but alter their quality of life, and have few effects on metastatic disease. In this way, it's necessary to develop new targeted therapies in order to have a better patient care. In the literature, targeted therapies are focus on the partner and signaling pathways regulated by EWSR1-FLI1. However, no targeted therapies have been found to act specifically on EWSR1-FLI1 expression beside some studies on the regulation of EWSR1-FLI1 stability. Thus, in the laboratory, we are interested in the identification of families acting on EWSR1-FLI1 expression. Thanks to a high throughput screening, we were able to identify 3 families of compounds of interest in Ewing's sarcoma, which two of them act on the stability of EWSR1-FLI1. The first family are the statins, compounds allowing the inhibition of HMGCR, one of the two limiting enzymes of the mevalonate pathway. During my PhD, we showed that the mevalonate pathway is essential in Ewing's sarcoma. Furthermore, it is regulated by EWSR1-FLI1 via the regulation of EGR2 susceptibility gene. We have also shown that Ewing cell lines and patient-derived xenografts show increased sensitivity to statins compared to other cancer cell lines. Our studies suggest that statins induce inhibition of the mevalonate pathway leading to a decrease of small GTPase protein prenylation, an increase of ROS levels and increase of lipid peroxidation. The deregulation of these molecular mechanisms result in a decrease in cell proliferation via a replication impairment, an increase of apoptosis. Finally, we have shown by in vivo studies that statins induce slow-down of tumor growth of different Ewing tumors PDX. The second and third families are the inhibitors of the ubiquitin-proteasome degradation Complex and the HDAC inhibitors (HDACi) characterized as stabilizers and destabilizers of EWSR1-FLI1, respectively. During my thesis, I was interested in HDACi that are able to destabilize EWSR1-FLI1. We showed that HDACi act on EWSR1-FLI1 by transcriptional and post-translational regulation and this effect is cell line dependent. On the other hand, we showed that EWSR1-FLI1 is acetylated in two Ewing cell lines and that this acetylation occurs mainly on K298. In parallel to this screen, we have shown that oxidative stress acts on the stability of EWSR1-FLI1 make, a promising target for the development of new therapies.Le sarcome d'Ewing, seconde tumeur osseuse pédiatrique, est une tumeur agressive et métastatique. Dans 85% des cas, cette tumeur est caractérisée par la translocation chromosomique t(11 ;22)(q24 ;q12) conduisant à l'expression de la protéine de fusion EWSR1-FLI1. EWSR1-FLI1 est un facteur de transcription aberrant considéré comme l'oncogène «driver» de la tumeur permettant de moduler l'expression de gènes spécifiques impliqués dans la prolifération, la migration et l'apoptose. La prise en charge des patients à ce jour associe de la chirurgie et de la chimiothérapie à forte dose, à de la radiothérapie. Ces traitements sont très efficaces sur les formes localisées mais n'ont que très peu d'effet lorsque le patient présente des métastases. C'est pourquoi, il est nécessaire de développer de nouvelles thérapies ciblées pour avoir une meilleure prise en charge des patients. Les thérapies ciblées développées actuellement s'intéressent aux partenaires et aux voies de signalisations régulées par EWSR1-FLI1. Actuellement, hormis des études sur la régulation de la stabilité de EWSR1-FLI1, aucune thérapie ciblée n'agit spécifiquement sur l'expression de EWSR1-FLI1. Au sein du laboratoire, nous nous sommes intéressés à l'identification de composés agissant sur la stabilité de EWSR1-FLI1 à l'aide d'une lignée d'Ewing générée par la méthode de génome « editing » CRISPR-Cas9 exprimant la protéine EWSR1-FLI1 fusionnée à une protéine fluorescente. Le crible a été effectué sur la plateforme Biophenics de l'institut Curie à l'aide d'une chimiothèque de médicaments approuvés par la FDA et d'une banque incluant des inhibiteurs impliqués dans les mécanismes de régulations épigénétiques, dans les modifications post-traductionnelles et dans le complexe de dégradation protéique ubiquitine-protéasome. A partir de la première banque de composés approuvés par la FDA, nous avons identifié les statines comme une famille de composés cytotoxiques pour la tumeur d'Ewing. Nous avons pu montrer que les lignées cellulaires d'Ewing et les cellules issues de tumeurs xénogreffées dérivées de patients (PDX) ont une sensibilité accrue aux statines comparées à d'autres lignées cancéreuses. Les statines sont une famille de composés inhibant l'enzyme HMGCR, une des deux enzymes limitantes de la voie du mévalonate. Nous avons pu montrer que la voie du mévalonate est essentielle dans le sarcome d'Ewing et l'expression de 4 enzymes clés de cette voie métabolite dont l'enzyme HMGCR est régulée par EWSR1-FLI1 via EGR2, gène de susceptibilité du sarcome d'Ewing. Nos études montrent que les statines, en inhibant la voie du mévalonate, induisent une augmentation du niveau des ROS et de la peroxydation des lipides ainsi qu'une diminution de la prénylation des petites protéines G. La dérégulation de ces mécanismes moléculaires conduit à une diminution de la prolifération cellulaire caractérisée par un ralentissement de la vitesse de réplication et à une augmentation de l'apoptose. De plus, nous avons montré par des études in vivo que les statines ralentissaient la croissance de différents PDX issues de tumeurs d'Ewing. A partir de la deuxième banque, nous avons identifié que les inhibiteurs du complexe de dégradation ubiquitine-protéasome et des HDAC (HDACi) agissent respectivement comme des stabilisateurs et des déstabilisateurs de EWSR1-FLI1. Durant ma thèse, je me suis intéressé au rôle des HDACi sur l'expression de EWSR1-FLI1. Nous avons pu montrer un effet transcriptionnel et post-traductionnel des HDACi sur EWSR1-FLI1 suivant les lignées d'Ewing utilisées. Nous avons montré également que la protéine EWSR1-FLI1 est acétylée dans sa partie FLI1 au niveau du résidu lysine K298. Son rôle sur la stabilité de la protéine EWSR1-FLI1 est en cours d'étude. En parallèle de ce crible, nous avons montré, que le stress oxydatif agissait sur la stabilité de EWSR1-FLI1 faisant une cible prometteuse pour développer de nouvelles thérapies

Upregulation of the Mevalonate Pathway through EWSR1-FLI1/EGR2 Regulatory Axis Confers Ewing Cells Exquisite Sensitivity to Statins

Ewing sarcoma (EwS) is an aggressive primary bone cancer in children and young adults characterized by oncogenic fusions between genes encoding FET-RNA-binding proteins and ETS transcription factors, the most frequent fusion being EWSR1-FLI1. We show that EGR2, an Ewing-susceptibility gene and an essential direct target of EWSR1-FLI1, directly regulates the transcription of genes encoding key enzymes of the mevalonate (MVA) pathway. Consequently, Ewing sarcoma is one of the tumors that expresses the highest levels of mevalonate pathway genes. Moreover, genome-wide screens indicate that MVA pathway genes constitute major dependencies of Ewing cells. Accordingly, the statin inhibitors of HMG-CoA-reductase, a rate-limiting enzyme of the MVA pathway, demonstrate cytotoxicity in EwS. Statins induce increased ROS and lipid peroxidation levels, as well as decreased membrane localization of prenylated proteins, such as small GTP proteins. These metabolic effects lead to an alteration in the dynamics of S-phase progression and to apoptosis. Statin-induced effects can be rescued by downstream products of the MVA pathway. Finally, we further show that statins impair tumor growth in different Ewing PDX models. Altogether, the data show that statins, which are off-patent, well-tolerated, and inexpensive compounds, should be strongly considered in the therapeutic arsenal against this deadly childhood disease