Mitochondriopathien als Ursache des renalen Fanconi-Syndroms

Das renale Fanconi-Syndrom wird definiert als Einschränkung des proximal tubulären Transports und kann durch eine Vielzahl von Faktoren ausgelöst werden. Neben sogenannten sekundären Formen als Folge einer anderen Erkrankung oder als Nebenwirkung einer therapeutischen Behandlung gibt es auch primäre Formen, die als direkte Konsequenz einer Mutation auftreten. In dieser Arbeit sollten zwei dieser Formen untersucht werden, die beide autosomal dominant vererbt werden. Zum einen handelt es sich dabei um das peroxisomale Protein EHHADH, das dort an der β-Oxidation beteiligt ist. Zum anderen um FAP2, einen Bestandteil der Kreatin-Synthese. Für EHHADH war bereits bekannt, dass es im späten proximalen Tubulus der Niere exprimiert wird. Dieses Ergebnis wurde mit Hilfe zweier weiterer Antikörper bestätigt. Sowohl die Immunfluoreszenz mit einem weiteren Antikörper gegen EHHADH als auch mit einem Antikörper gegen das peroxisomale Protein D-Amino acid oxidase ergab ein Signal im corticalen Bereich der Niere im spät-proximalen Tubulus (S2/S3-Segment). Die beobachtete granuläre Verteilung stand im Einklang mit der Verteilung der Peroxisomen. Dies ließ den Schluss zu, dass EHHADH in den Peroxisomen des spät-proximalen Tubulus exprimiert wird. In Vorarbeiten konnte nachgewiesen werden, dass mutiertes EHHADH zusätzlich in die Mitochondrien importiert wird. Die genaue intramitochondriale Lokalisation wurde elektronenmikroskopisch mit Hilfe der ReAsH-Methode untersucht. Bei den mit EHHADHWT transfizierten Zellen waren nur die Peroxisomen positiv. In den Mitochondrien war kein Niederschlag erkennbar. Im Gegensatz dazu hatten mit EHHADHMUT transfizierte Zellen sowohl positive Peroxisomen als auch Mitochondrien. In meiner Diplomarbeit habe ich festgestellt, dass der mitochondriale Import von EHHADH eine Beeinträchtigung der oxidativen Phosphorylierung zur Folge hat. Um zu überprüfen, ob sich dies analog zu den Fanconi-Patienten tatsächlich auf den transzellulären Transport auswirkt, wurde auf Filtern gewachsenen Zellen das Glucose-Derivat α-D-Methylglucosid angeboten. Dies wird von Na+-Glucose-Cotransportern transportiert, in den Zellen jedoch nicht umgesetzt. Dabei zeigte sich, dass die EHHADHMUT-Zellen nur rund ein Viertel der Transportkapazität der Wildtypzellen hatten. Diese Daten erlauben nun neue Einblicke in die Pathogenese dieses speziellen Fanconi-Syndroms. EHHADHMUT wird fälschlicherweise in die Mitochondrien importiert, wo es die mitochondriale β-Oxidation beeinträchtigt. Dies führt schlussendlich zu einer verringerten ATP-Synthese und einer erniedrigten Transportkapazität im proximalen Tubulus der betroffenen Patienten. Bei FAP2 handelt es sich im Gegensatz zu EHHADH um ein genuines mitochondriales Protein. Die Lokalisation in der Niere konnte auf den frühen proximalen Tubulus eingegrenzt werden, wo es in den Mitochondrien lokalisiert war. Spät-proximale Tubuli sowie medulläre Segmente waren negativ für FAP2. Mit Hilfe einer stabil transfizierten Zelllinie wurde eine Mutation im FAP2-Gen näher untersucht. Zellen, welche FAPWT überexprimierten, wiesen einen relativ milden Phänotyp auf. Die Mitochondrien erschienen fragmentiert und geschwollen, was in der Elektronenmikroskopie bestätigt wurde. Dies ist vermutlich der Überexpression von FAP2WT und dem damit verbundenen vermehrten Import von FAP2WT in die Mitochondrien geschuldet. Zellen, die FAP2MUT überexprimierten, enthielten massiv veränderte Mitochondrien. Die Mitochondrien waren stark elongiert und durchzogen die gesamte Zelle. In der Elektronenmikroskopie waren in den Mitochondrien der FAP2MUT-Zellen filamentartige Strukturen erkennbar. Mit Hilfe der Immuno-Gold-Markierung konnte die Beteiligung von FAP2MUT am Aufbau der Filamente nachgewiesen werden. Die Halbwertszeit des mutierten FAP2-Proteins war drastisch verlängert. Dies deutet darauf hin, dass das in Filamenten befindliche FAP2MUT-Protein nicht mehr normal degradiert werden konnte. Trotz der massiv veränderten Mitochondrienmorphologie konnte in respiratorischen Messungen der oxidativen Phosphorylierung kein deutlicher Unterschied zwischen FAP2WT- und FAP2MUT-Zellen beobachtet werden. Das Fanconi-Syndrom scheint bei diesen Patienten also nicht durch eine Einschränkung der Energiebereitstellung verursacht zu werden. Zudem konnte eine Biopsie einer Patientenniere untersucht werden. Eine Hämalaun/Eosin-Färbung ergab gut erhaltene distale Segmente und Glomeruli. Die proximalen Abschnitte Zeichen einer tubulären Schädigung. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen waren in den proximalen Tubuluszellen ebenfalls Riesenmitochondrien erkennbar, die filamentartige Einschlüsse enthielten. Diese Befunde legen nahe, dass das Auftreten der intramitochondrialen Ablagerungen kein Zellkulturartefakt ist, sondern diese filamentartigen Strukturen auch in vivo am Entstehen der Erkrankung beteiligt sind. Das beobachtete Fanconi-Syndrom sowie die Niereninsuffizienz scheinen jedoch nicht die Folge einer beeinträchtigten oxidativen Phosphorylierung zu sein. Der zu Grunde liegende Pathomechanismus konnte jedoch noch nicht aufgeklärt werden. Die in dieser Arbeit untersuchten Formen des renalen Fanconi-Syndroms entstehen beide in Folge einer Mitochondriopathie. Während im Falle der EHHADH-Mutation eine verminderte Energiebereitstellung krankheitsauslösend zu sein scheint, sind die Pathomechanismen bei FAP2 komplexer und bedürfen weiterführender Untersuchungen, für die die hier dargestellten Befunde eine Ausgangsbasis bilden

Cardiac Fibrosis Is a Risk Factor for Severe COVID-19

Increased left ventricular fibrosis has been reported in patients hospitalized with coronavirus disease 2019 (COVID-19). It is unclear whether this fibrosis is a consequence of severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2) infection or a risk factor for severe disease progression. We observed increased fibrosis in the left ventricular myocardium of deceased COVID-19 patients, compared with matched controls. We also detected increased mRNA levels of soluble interleukin-1 receptor-like 1 (sIL1-RL1) and transforming growth factor β1 (TGF-β1) in the left ventricular myocardium of deceased COVID-19 patients. Biochemical analysis of blood sampled from patients admitted to the emergency department (ED) with COVID-19 revealed highly elevated levels of TGF-β1 mRNA in these patients compared to controls. Left ventricular strain measured by echocardiography as a marker of pre-existing cardiac fibrosis correlated strongly with blood TGF-β1 mRNA levels and predicted disease severity in COVID-19 patients. In the left ventricular myocardium and lungs of COVID-19 patients, we found increased neuropilin-1 (NRP-1) RNA levels, which correlated strongly with the prevalence of pulmonary SARS-CoV-2 nucleocapsid. Cardiac and pulmonary fibrosis may therefore predispose these patients to increased cellular viral entry in the lung, which may explain the worse clinical outcome observed in our cohort. Our study demonstrates that patients at risk of clinical deterioration can be identified early by echocardiographic strain analysis and quantification of blood TGF-β1 mRNA performed at the time of first medical contact

Renal Fanconi Syndrome Is Caused by a Mistargeting-Based Mitochondriopathy

Summary: We recently reported an autosomal dominant form of renal Fanconi syndrome caused by a missense mutation in the third codon of the peroxisomal protein EHHADH. The mutation mistargets EHHADH to mitochondria, thereby impairing mitochondrial energy production and, consequently, reabsorption of electrolytes and low-molecular-weight nutrients in the proximal tubule. Here, we further elucidate the molecular mechanism underlying this pathology. We find that mutated EHHADH is incorporated into mitochondrial trifunctional protein (MTP), thereby disturbing β-oxidation of long-chain fatty acids. The resulting MTP deficiency leads to a characteristic accumulation of hydroxyacyl- and acylcarnitines. Mutated EHHADH also limits respiratory complex I and corresponding supercomplex formation, leading to decreases in oxidative phosphorylation capacity, mitochondrial membrane potential maintenance, and ATP generation. Activity of the Na+/K+-ATPase is thereby diminished, ultimately decreasing the transport activity of the proximal tubule cells. : Assmann et al. examine the molecular mechanism underlying a recently described Fanconi syndrome. Mistargeting of the peroxisomal protein EHHADH to mitochondria leads to impaired mitochondrial fatty acid β-oxidation and respiration, resulting in decreased ATP production. Diminished transport activity leads to the observed Fanconi syndrome. Keywords: Fanconi syndrome, mitochondriopathy, fatty acid oxidation, supercomplexe

Mistargeting of peroxisomal EHHADH and inherited renal Fanconi's syndrome

BACKGROUND In renal Fanconi's syndrome, dysfunction in proximal tubular cells leads to renal losses of water, electrolytes, and low-molecular-weight nutrients. For most types of isolated Fanconi's syndrome, the genetic cause and underlying defect remain unknown. METHODS We clinically and genetically characterized members of a five-generation black family with isolated autosomal dominant Fanconi's syndrome. We performed genomewide linkage analysis, gene sequencing, biochemical and cell-biologic investigations of renal proximal tubular cells, studies in knockout mice, and functional evaluations of mitochondria. Urine was studied with the use of proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) spectroscopy. RESULTS We linked the phenotype of this family's Fanconi's syndrome to a single locus on chromosome 3q27, where a heterozygous missense mutation in EHHADH segregated with the disease. The p.E3K mutation created a new mitochondrial targeting motif in the N-terminal portion of EHHADH, an enzyme that is involved in peroxisomal oxidation of fatty acids and is expressed in the proximal tubule. Immunocytofluorescence studies showed mistargeting of the mutant EHHADH to mitochondria. Studies of proximal tubular cells revealed impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and defects in the transport of fluids and a glucose analogue across the epithelium. 1H-NMR spectroscopy showed elevated levels of mitochondrial metabolites in urine from affected family members. Ehhadh knockout mice showed no abnormalities in renal tubular cells, a finding that indicates a dominant negative nature of the mutation rather than haploinsufficiency. CONCLUSIONS Mistargeting of peroxisomal EHHADH disrupts mitochondrial metabolism and leads to renal Fanconi's syndrome; this indicates a central role of mitochondria in proximal tubular function. The dominant negative effect of the mistargeted protein adds to the spectrum of monogenic mechanisms of Fanconi's syndrome. (Funded by the European Commission Seventh Framework Programme and others.

Glycine Amidinotransferase (GATM), Renal Fanconi Syndrome, and Kidney Failure

Background For many patients with kidney failure, the cause and underlying defect remain unknown. Here, we describe a novel mechanism of a genetic order characterized by renal Fanconi syndrome and kidney failure. Methods We clinically and genetically characterized members of five families with autosomal dominant renal Fanconi syndrome and kidney failure. We performed genome-wide linkage analysis, sequencing, and expression studies in kidney biopsy specimens and renal cells along with knockout mouse studies and evaluations of mitochondrial morphology and function. Structural studies examined the effects of recognized mutations. Results The renal disease in these patients resulted from monoallelic mutations in the gene encoding glycine amidinotransferase (GATM), a renal proximal tubular enzyme in the creatine biosynthetic pathway that is otherwise associated with a recessive disorder of creatine deficiency. In silico analysis showed that the particular GATM mutations, identified in 28 members of the five families, create an additional interaction interface within the GATM protein and likely cause the linear aggregation of GATM observed in patient biopsy specimens and cultured proximal tubule cells. GATMaggregates-containing mitochondria were elongated and associated with increased ROS production, activation of the NLRP3 inflammasome, enhanced expression of the profibrotic cytokine IL-18, and increased cell death. Conclusions In this novel genetic disorder, fully penetrant heterozygous missense mutations in GATM trigger intramitochondrial fibrillary deposition of GATM and lead to elongated and abnormal mitochondria. We speculate that this renal proximal tubular mitochondrial pathology initiates a response from the inflammasome, with subsequent development of kidney fibrosis