Effect of operational parameters on methanol biofiltration coupled with Endochitinase 42 production

"En la presente tesis se estudió la biofiltración de metanol acoplada con la producción de proteínas heterólogas. Para ello, se utilizó un cultivo de P. pastoris transformado con el gen Ech42 responsable de producir la Endoquitinasa 42 de Trichoderma Atroviride (Pérez-Martínez et al., 2007). Se diseñaron tres biofiltros idénticos y se operaron bajo diferentes condiciones de carga de metanol, concentración de nitrógeno, pH y tiempo de residencia. La máxima capacidad de eliminación de metanol observada fue de 643.5 g/m3*h a una carga de metanol de 800 g/m3*h, 5 g/L (NH4)2SO4, pH 5 y 60 segundos de tiempo de residencia. La actividad de Ech42 varió entre 578 y 1172 U/L siendo el pH el parámetro más importante para el proceso. Además, se encontró que la capacidad de eliminación del sistema fue muy sensible a los cambios de condiciones manejadas. Sin embargo, la actividad de la proteína heteróloga fue notablemente estable. Por otro lado, también se estudió la divergencia del sistema a través de un análisis estadístico simple, microscopía electrónica de barrido y análisis cinético, durante las primeras tres etapas de operación. Se observó que dos o más sistemas de biofiltración pueden comportarse de distinta manera con el tiempo, aún y cuando son operados bajo las mismas condiciones. Algunas explicaciones probables son los procesos aleatorios de colonización de otras especias así como la impredecible evolución de comunidades microbianas. En cualquier caso, los resultados mostrados en esta tesis son el primer reporte de divergencia en biofiltros. Finalmente, se desarrolló un modelo matemático dinámico para describir el desempeño de los sistemas de biofiltración acoplados a la producción de proteínas. Éste se basó en ecuaciones para reactores CSTR (Completely Stirred Tank Reactor) pero en una estructura discretizada del sistema. Para la degradación de metanol se utilizó el modelo de Monod. Se consideró la presencia de dos grupos de microorganismos creciendo en los sistemas: P. pastoris y otros microorganismos. El modelo mostró un buen ajuste en relación con las capacidades de eliminación experimentales y la producción proteica. Sin embargo, fue difícil ajustar los valores experimentales de biomasa total presente (volumen). Tal discrepancia puede deberse a que el modelo no considera biomasa inerte. Por lo anterior, es recomendable que el modelo matemático sea modificado o replanteado.""In this thesis, methanol biofiltration coupled with heterologous protein production was studied. A P. pastoris strain transformed with the gen Ech42 responsible for producing Endochitinase 42 (Ech42) was used (Pérez-Martínez et al., 2007). Three different biofilters were designed and tested under different methanol loads, nitrogen concentrations, pH and EBRT (Empty Bed Residence Time) conditions. The maximum elimination capacity observed was 643.5 g/m3*h under a methanol load of 800 g/m3*h, 5 g/L (NH4)2SO4, pH 5 and 60 seconds of EBRT. Also, the Ech42 activity ranged from 578 to 1172 U/L and was mainly affected by pH changes. Additionally, it was observed that EC was very sensitive to changes under the mentioned operational conditions. However, the heterologous protein activity was quite stable. On the other hand, divergence in the system was approached. It was noted that two or more systems operating under identical conditions can behave differently over time. Thus, repeatability in biofiltration shouldn’t be taken for granted. Some probable explanations for such divergence are the random colonization of foreign species as well as the unpredictable evolution of microbial communities. In any case, this is the first report of operational divergence in biofilters. Finally, a dynamic mathematical model was developed based on CSTR equations. A Monod kinetic was used in order to describe methanol consumption behavior. Also, microbial growth was considered for two different kinds of microorganisms: P. pastoris and others. The model fit well with experimental elimination capacities and protein production. However, total biomass volume was not well described. The source of the model discrepancy could be the failure to consider inert biomass. Therefore, the mathematical model must be further explored.

NA

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Ambientales"La fermentación oscura es la alternativa más factible para la producción biológica de hidrógeno (H2). Este bioproceso depende de la capacidad metabólica de microorganismos anaerobios que utilizan sustratos orgánicos y producen una mezcla de ácidos carboxílicos e H2 como subproductos. En procesos continuos, la fermentación oscura ha mostrado ser estable y con altas productividades, especialmente en reactores de biomasa suspendida. Sin embargo, los rendimientos molares de H2 reportados en la literatura se mantienen alejados de los valores teóricos (4 mol H2/mol hexose). Recientemente, la homoacetogénesis y la fermentación ácido láctica han sido identificadas como causas probables de los desempeños subóptimos de la producción de H2. En este trabajo se evaluaron diferentes parámetros de operación con el objetivo de identificar y entender las condiciones que desencadenan la homoacetogénesis y la fermentación ácidoláctica durante la producción de H2 en reactores continuous de tanque agitado. Se demostró que el tiempo de retención hidráulico (TRH) es un factor crítico que controla la composición de las comunidades microbianas de la fermentación oscura. Valores de TRH entre 6 y 12 h favorecen el surgimiento de una comunidad microbiana dominada por las familias Clostridiaceae-LachnospiraceaeEnterobacteriaceae, las cuales llevan a cabo metabolismos asociados con la producción de H2. En dichas condiciones, se obtuvo una velocidad volumétrica de producción de H2 (VVPH) de 2 L H2/L-d. En contraste, valores de TRH entre 18 y 24 h derivaron en el establecimiento de una comunidad microbiana de Sporolactobacillaceae-Streptococcaceae, que llevó a cabo la fermentación ácido láctica y desplazó a las bacterias productoras de H2. Asimismo, la VVPH disminuyó hasta un mínimo de 0.6 L H2/L-d. Posteriormente, bajo condiciones fijas de TRH (6 h), se encontró que la operación a velocidades de carga orgánica (VCO) bajas (14.7– 44.1 g lactosa/L-d) estuvo asociada con el dominio de Clostridium spp. Dichas condiciones favorecieron las rutas metabólicas del ácido acético y butírico, con un rendimiento molar de H2 de 2.14 mol H2/mol hexosa y una VVPH entre 3.2 y 11.6 L H2/L-d. En contraste, VCO relativamente altas (58.8 y 88.2 g lactosa/L-d) favorecieron la aparición de Streptococcus spp. como bacteria co-dominante en la comunidad microbiana, cuya presencia derivó en la producción de ácido láctico. Bajo estas condiciones, la producción de ácido fórmico también se favoreció, sirviendo posiblemente como estrategia para disponer el exceso de moléculas reducidas (e.g. NADH). En este escenario, la VVPH incrementó (13.7–14.5 L H2/L-d), pero el rendimiento molar de H2 disminuyó hasta 0.74 mol H2/mol hexosa. Después de analizar los resultados previos, se sugirió que la diversificación de las comunidades microbianas y de las rutas metabólicas estaba posiblemente asociada con un fenómeno de inhibición causado por la acumulación de ácidos carboxílicos ó H2. Por lo tanto, se evaluó el impacto de las condiciones de transferencia de H2 mediante la operación de reactores bajo distintos coeficientes de transferencia de masa (kLa). Se mostró que la VVPH y el rendimiento molar incrementaron 74 y 78%, respectivamente, como resultado de la mejora en las condiciones de transferencia de H2 hacia la fase gas. Este desempeño fue impulsado por una disminución de 53% en la concentración de H2 disuelto. Además, el análisis de 16S-DGGE reveló que la abundancia de Clostridium sp incrementó a valores de kLa ≥ 2.72 1/h (300 y 400 rpm) como respuesta a las menores concentraciones de H2 disuelto. Esta respuesta fue acompañada por un incremento de los rendimientos de ácidos acético y butírico. En general, TRH y cargas orgánicas bajas (6 h y ≤ 44.1 g lactose/L-d), así como coeficientes de transferencia de masa mayores a 2.72 1/h fueron identificadas como las condiciones más favorables para la producción eficiente de H2, evitando una diversificación de las comunidades microbianas y controlando las velocidades de consumo de H2 y de la fermentación ácido láctica.""Dark fermentation is the most feasible alternative for biological hydrogen (H2) production. Such bioprocess depends on the metabolic capacity of anaerobic microorganisms that use organic substrates and produce a mixture of short-chain carboxylic acids and H2 as byproducts. In continuous processes, dark fermentative hydrogen production has demonstrated to be stable and highly productive, especially in suspended-growth reactors. Nevertheless, the reported H2 yields remain far from theoretical values. In recent years, homoacetogenesis and lactic acid fermentation have been identified as possible causes of suboptimal performance of dark fermentation. In this regard, different operational parameters were evaluated with the aim to identify and understand the conditions that trigger homoacetogenesis and lactic acid fermentation during H2 production in continuous stirred tank reactors (CSTR). It was demonstrated that the hydraulic retention time (HRT) is a critical factor that shapes the microbial community of dark fermentation. It was shown that low values of HRT (6-12 h) favored the emergence of a microbial community dominated by Clostridiaceae-Lachnospiraceae-Enterobacteriaceae, which performed metabolic pathways co-producing H2. At these conditions, a maximum volumetric H2 production rate (VHPR) of 2 L H2/L-d was obtained. In contrast, large values of HRT (18-24 h) led to the establishment of a microbial community composed of Sporolactobacillaceae-Streptococcaceae that performed lactic acid fermentation and outcompeted H2-producing bacteria. At this stage, the VHPR dropped to a minimum of 0.6 L H2/L-d. Afterward, at fixed HRT conditions of 6 h, it was found that the operation at low organic loading rates (OLR) (14.7– 44.1 g lactose/L-d) was associated with the dominance of Clostridium spp. At such conditions, the acetate and butyrate metabolic pathways were mostly favored, with an associated H2 yield of 2.14 mol H2/mol hexose and VHPR between 3.2 and 11.6 L H2/L-d. In contrast, relatively high OLR (58.8 and 88.2 g lactose/L-d) favored the appearance of Streptococcus spp. as co-dominant bacteria leading to lactate production. The production of formate was also stimulated, possibly serving as a strategy to dispose the surplus of reduced molecules (e.g. NADH). In such scenario, VHPR was enhanced (13.7–14.5 L H2/L-d) but the H2 yield dropped to a minimum of 0.74 mol H2/mol hexose. In the light of these findings, it was suggested that the diversification of the microbial communities and the metabolic pathways were possibly associated with an inhibition phenomenon due to either the carboxylic acids or H2 accumulation. In this regard, the impact of the H2 mass transfer conditions was evaluated using a series of continuous stirred-tank reactors operated at H2 mass transfer coefficients (kLa) ranging from 1.04 to 4.23 1/h. It was demonstrated that the VHPR and H2 yield increased 74 and 78%, respectively, as a result of enhanced mass transfer conditions. This behavior was driven by a 53% decrease in the dissolved H2 concentration. Moreover, the 16S-DGGE analysis and sequencing revealed that Clostridium sp increased its occurrence at kLa ≥ 2.72 1/h (300 and 400 rpm) as response to lower dissolved H2 concentration. This was accompanied by an increase of acetate and butyrate yields. Overall, short HRT (6 h), low OLR (≤ 44.1 g lactose/L-d), and mass transfer coefficient above 2.72 1/h were identified as the most suitable conditions for efficient H2 production, avoiding excessive diversification of microbial communities and controlling the rates of H2 consumption by homoacetogenesis and lactic-acid fermentation."Esta tesis fue elaborada en los laboratorios de la División de Ciencias Ambientales del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C., bajo la dirección del Dr. Elías Razo-Flores. Durante la realización del trabajo, el autor recibió una beca académica del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (262218). Como parte de este trabajo se realizó una estancia de investigación internacional con el apoyo de una Beca Mixta CONACYT en el Laboratoire de Biotechnologie de l’Environment perteneciente al Institute National de la Recherche Agronomique (INRA) en Narbonne, Francia, bajo la supervisión del Dr. Nicolas Bernet. Asimismo, se contó con el apoyo del proyecto BITA FP7-PEOPLE-2011-IRSES, proyecto 295170 “Bioprocess and Control Engineering for Wastewater Treatment”. El trabajo de investigación fue financiado por el Fondo SENER-CONACYT Sustentabilidad Energética, Clúster Biocombustibles Gaseosos, proyecto 24700

The Changing Landscape for Stroke\ua0Prevention in AF: Findings From the GLORIA-AF Registry Phase 2

Background GLORIA-AF (Global Registry on Long-Term Oral Antithrombotic Treatment in Patients with Atrial Fibrillation) is a prospective, global registry program describing antithrombotic treatment patterns in patients with newly diagnosed nonvalvular atrial fibrillation at risk of stroke. Phase 2 began when dabigatran, the first non\u2013vitamin K antagonist oral anticoagulant (NOAC), became available. Objectives This study sought to describe phase 2 baseline data and compare these with the pre-NOAC era collected during phase 1. Methods During phase 2, 15,641 consenting patients were enrolled (November 2011 to December 2014); 15,092 were eligible. This pre-specified cross-sectional analysis describes eligible patients\u2019 baseline characteristics. Atrial fibrillation disease characteristics, medical outcomes, and concomitant diseases and medications were collected. Data were analyzed using descriptive statistics. Results Of the total patients, 45.5% were female; median age was 71 (interquartile range: 64, 78) years. Patients were from Europe (47.1%), North America (22.5%), Asia (20.3%), Latin America (6.0%), and the Middle East/Africa (4.0%). Most had high stroke risk (CHA2DS2-VASc [Congestive heart failure, Hypertension, Age  6575 years, Diabetes mellitus, previous Stroke, Vascular disease, Age 65 to 74 years, Sex category] score  652; 86.1%); 13.9% had moderate risk (CHA2DS2-VASc = 1). Overall, 79.9% received oral anticoagulants, of whom 47.6% received NOAC and 32.3% vitamin K antagonists (VKA); 12.1% received antiplatelet agents; 7.8% received no antithrombotic treatment. For comparison, the proportion of phase 1 patients (of N = 1,063 all eligible) prescribed VKA was 32.8%, acetylsalicylic acid 41.7%, and no therapy 20.2%. In Europe in phase 2, treatment with NOAC was more common than VKA (52.3% and 37.8%, respectively); 6.0% of patients received antiplatelet treatment; and 3.8% received no antithrombotic treatment. In North America, 52.1%, 26.2%, and 14.0% of patients received NOAC, VKA, and antiplatelet drugs, respectively; 7.5% received no antithrombotic treatment. NOAC use was less common in Asia (27.7%), where 27.5% of patients received VKA, 25.0% antiplatelet drugs, and 19.8% no antithrombotic treatment. Conclusions The baseline data from GLORIA-AF phase 2 demonstrate that in newly diagnosed nonvalvular atrial fibrillation patients, NOAC have been highly adopted into practice, becoming more frequently prescribed than VKA in Europe and North America. Worldwide, however, a large proportion of patients remain undertreated, particularly in Asia and North America. (Global Registry on Long-Term Oral Antithrombotic Treatment in Patients With Atrial Fibrillation [GLORIA-AF]; NCT01468701