High resolution photonic force microscopy based on sharp nano-fabricated tips

Sub-nm resolution images can be achieved by Atomic Force Microscopy (AFM) on samples that are deposited on hard substrates. However, it is still extremely challenging to image soft interfaces, such as biological membranes, due to the deformations induced by the tip. Photonic Force Microscopy (PhFM), based on optical tweezers (OT), represents an interesting alternative for soft scanning-probe microscopy. Using light instead of a physical cantilever to hold the scanning probe results in a stiffness ($k_{OT}\sim0.1-0.001$ pN/nm) which can be 2-3 orders of magnitude lower than that of standard cantilevers ($k_{AFM}\sim 10$ pN/nm). Combined with nm resolution of displacement measurements of the trapped probe, this allows for imaging soft materials without force-induced artefacts. However, the size of the optically trapped probe, often chosen as a $\sim \mu$m-size sphere, has so far limited the resolution of PhFM. Here we show a novel and simple nanofabrication protocol to massively produce optically trappable quartz particles which mimic the sharp tips of AFM. We demonstrate and quantify the stable trapping of particles with tips as sharp as 35 nm, the smallest used in PhFM to date. Raster scan images of rigid nanostructures with features smaller than 80 nm obtained with our tips compare well with AFM images of the same samples. Imaging the membrane of living malaria-infected red blood cells produces no visible artefacts and reveals the sub-micron structural features termed knobs, related to the parasite activity within the cell. The use of nano-engineered particles in PhFM opens the way to imaging soft and biological samples at high resolution

Aspects moléculaires et cellulaires des modifications induites par Plasmodium falciparum dans le globule rouge humain parasité

Ma thèse s'inscrit dans l'étude des modifications du globule rouge humain induites par P. falciparum. Ces modifications qui représentent une remarquable adaptation du parasite à un environnement plus complexe qu'il n'y paraît au premier abord et expliquent sa persistance chez l'Homme sont détaillées dans une revue et un chapitre de livre dont je suis co-auteur. Mes travaux de recherche ont porté sur la caractérisation fonctionnelle des structures de Maurer, un compartiment membranaire exporté par le parasite dans le globule rouge parasitaire et directement lié à la physiopathologie du paludisme grave. J'ai contribué à la caractérisation fonctionnelle de nouvelles protéines de ces structures, codées par trois familles multigéniques sub-télomériques en cluster avec la famille Pfmc-2tm, et présentant de façon étonnante un fort degré de conservation (article 1). La diminution d'expression de ces gènes, obtenue par titration d'un facteur transcriptionnel, entraine un défaut de libération des mérozoïtes. Mon deuxième projet porte sur l'identification des modalités d'export de la protéine transmembranaire résidente des structures de Maurer PfSBP1. Mes travaux montrent que PfSBP1 est exportée sous forme soluble dans le cytoplasme érythrocytaire, en interaction avec le complexe chaperon parasitaire PfTCP1 (article 2).Plasmodium falciparum causes the most severe forms of human malaria, a pathology associated with the erythrocytic asexual stages of the parasite. My work focused on the remodeling of the infected erythrocytes induced by P. falciparum and detailed in a review and a book chapter that I co-authored. These modifications illustrate a remarkable adaptation of P. falciparum resulting in its persistence in humans. My PhD thesis was dedicated to the functional characterization of Maurer's clefts, a membrane compartment transposed by the parasite in the cytoplasm of its host cell, and central to the export of virulence factors to the host cell surface. I have conducted two projects and contributed first to the functional characterization of novel exported protein encoded by three highly conserved multigene sub-telomeric families in cluster with the Pfmc-2tm family. Down regulation of these gene families by promoter titration impacted the release of infectious merozoites from the host cell (annex 1). My second project was dedicated to the identification of the modality of export of the resident and Maurer's clefts transmembrane protein PfSBP1. I have shown that PfSBP1 is exported as a soluble protein in the host cell cytoplasm in interaction with the parasite Thermosome complex protein 1 (PfTCP1) chaperone complex (annex 2).MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Analyse protéomique et fonctionnelle des structures de Maurer, un compartiment sécrétoire de Plasmodium falciparum impliqué dans son développement érythrocytaire

PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF

Etude génétique de PbSUB2, une subtilisine essentielle au développement de Plasmodium berghei in vivo (vers la définition d'une cible thérapeutique)

PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF

Mise en place et dynamique des modifications du globule rouge induites par le parasite Plasmodium falciparum

Plasmodium falciparum exporte des protéines parasitaires dans le cytoplasme et à la membrane de sa cellule hôte, l'érythrocyte. Cela permet lui permet de modifier sa cellule hôte et d'assurer sa survie et sa dissémination. Parmi ces modifications, les structures de Maurer constituent un compartiment sécrétoire original exporté par le parasite dans le cytoplasme de l'érythrocyte. Notre travail s'intéresse particulièrement à la caractérisation des structures de Maurer, dans le but de mieux comprendre sa biogenèse et ses fonctions biologiques. Une étude protéomique des fantômes de globules rouges parasités (ghosts) contenant les structures de Maurer, la membrane et le squelette sous-membranaire du globule rouge a identifié PfRhopH2, une protéine localisée dans les rhoptries. Nous avons au cours de ce travail caractérisé sa présence dans le cytoplasme du globule rouge parasité. Nous avons montré aussi que les structures de Maurer contiennent des micro-domaines membranaires de type lipid rafts, et que les protéines transmembranaires de ce compartiment transitent dans le cytoplasme du globule rouge sous une forme soluble, et n'adoptent une topologie transmembranaire qu'aux structures de Maurer. Nous nous sommes intéressés également aux interactions protéines-protéines dans le cytoplasme du globule rouge, notamment entre protéines humaine et parasitaire. Nous avons ainsi mis en évidence une interaction entre la protéine 14-3-3 humaine et PfEMP1 qui est phosphorylée, et montré son rôle dans la mise en place des knobs, une autre modification majeure du globule rouge, induite par le parasite. Nous avons montré aussi que l'interaction entre PfSBP1 localisée dans les structures de Maurer et LANCL1, une protéine périphérique du globule rouge, dépend de l'état de phosphorylation de PfSBP1. Ces deux études soulignent l'importance de la phosphorylation des protéines parasitaires dans le cytoplasme du globule rouge. La dernière approche de notre travail a ainsi consisté à faire une étude phosphoprotéomique des ghosts. A terme notre analyse devrait permettre de mieux comprendre la mise en place et la dynamique des modifications du globule rouge induites par Plasmodium falciparum. Mots clés : Paludisme, Plasmodium falciparum, structures de Maurer, knobs, lipid rafts, transport de protéines, interactions protéines-protéines, phosphorylation, phosphatase.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Host urokinase-type plasminogen activator participates in the release of malaria merozoites from infected erythrocytes

International audienceMalaria infection of red blood cells is associated with plasminogen activation. Surface immunofluorescence and immunoprecipitation experiments, using specific polyclonal and monoclonal antibodies raised against human urokinase, demonstrate that this activity is due to the binding of host urokinase-type plasminogen activator to the surface of erythrocytes infected by mature forms of Plasmodium falciparum malaria parasites. Depletion of urokinase from the culture medium leads to the inhibition of merozoite release and the accumulation of segmenter-infected erythrocytes; this inhibition is reversed by the addition of human single-chain or two-chain urokinase. These findings are consistent with host urokinase being involved in the process of merozoite release from the red blood cell

Le trafic des protéines et le remodelage de la cellule hôte dans l'infection par le parasite du paludisme

Pour assurer ses besoins de croissance, multiplication, et survie, Plasmodium modifie sa cellule hôte, l'érythrocyte, après l'invasion. Le parasite met en place ainsi un système d'échanges (import/export) avec sa cellule hôte et le milieu extérieur. Nous avons identifié dans la base de données de Plasmodium berghei, le parasite de rongeurs, une famille de gènes, sep, correspondant à la famille etramp chez Plasmodium falciparum. Cette famille de gènes code pour des petites protéines exportées, et conservées dans tout le genre Plasmodium. Les protéines SEP (13?16 kDa) contiennent en N-terminal un peptide signal prédit, un domaine hydrophobe interne, et elles diffèrent au niveau des régions C-terminal et 3' UTR. Toutefois, les protéines SEP sont exprimées à différents moments du cycle de Plasmodium. Durant le cycle érythrocytaire, PbSEP1 et PbSEP3 sont exprimées à partir du stade trophozoïte, et la même quantité de protéine est détectée au stade schizonte et gamétocyte, pendant que PbSEP3 est hautement détectée dans les trophozoïtes mûrs et les gamétocytes. Chez le moustique, PbSEP1 et PbSEP3 sont détectées seulement chez les ookinètes, alors que PbSEP2 est très abondante dans les ookinètes, oocystes, et sporozoïtes des glandes salivaires. Les protéines SEP ont également des localisations différentes. Dans l'érythrocyte, PbSEP1 est localisée dans la membrane de la vacuole parasitophore, alors que PbSEP2 et PbSEP3 sont exportées au-delà de cette vacuole, et sont ainsi localisées dans la cellule hôte, en association avec des structures vésiculaires. Dans cette étude, nous avons identifié les signaux d'adressage des protéines SEP dans la vacuole parasitophore et dans la cellule hôte, chez Plasmodium berghei. L'autre partie du travail, effectuée à l'Université de Montpellier II, a consisté à étudier la localisation de deux protéines du squelette sous- membranaire de l'érythrocyte, la dématine, et l'adducine, durant le développement intra-érythrocytaire de Plasmodium falciparum. Le but de cette étude étant d'identifier un mécanisme potentiel d'internalisation des composants du squelette sous-membranaire de l'érythrocyte dans le parasite. Des études d'immuno-localisation ont montré que la dématine et l'adducine sont internalisées à partir du stade trophozoïte, et sont localisées probablement à la vacuole parasitophore (membrane et/ou lumière). Cette internalisation a été confirmée par des études de fractionnement cellulaire et d'accessibilité à la protéinase K, montrant que la dématine est totalement internalisée, alors l'adducine ne l'est que partiellement, suggérant une localisation de la protéine à la périphérie du parasite.Plasmodium endurance depends on the ability of the parasite to reorganize the cytosol of the erythrocyte, a terminally differentiated cell, and remodel its skeleton membrane immediately after invasion. In this way the parasite can organize the import/export of the molecules necessary to its survival. The comprehension of cellular trafficking mechanisms which occur during Plasmodium infection is a very important step and fundamental contribute to understand the biology of the malaria parasite.We identified in database of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei the gene family sep, corresponding to etramp in P. falciparum, encoding small exported proteins conserved in the genus Plasmodium. SEP proteins (13?16 kDa) contain a predicted signal peptide at the NH2-terminus, an internal hydrophobic region while they differ in their C-terminal region; the genes share the upstream regulative region while differ in the 3' UTR. Despite this, we showed that SEPs have a different timing of expression and a different localization: in the erythrocytic cycle PbSEP1 and PbSEP3 start to be expressed at trophozoite and the same amount of protein is detected also in schizonts and gametocytes, while PbSEP2 is highly detected in mature trophozoites and even more in gametocytes. In mosquitoes stages PbSEP1 and PbSEP3 are expressed only in ookinetes, while PbSEP2 is very abundant in ookinetes, oocysts and in sporozoites of the salivary glands. SEPs also have a different localization in the iRBC: PbSEP1 is targeted to the membrane of the parasitophorous vacuole, while PbSEP2 and 3 are exported beyond the parasite membrane and translocated to the host cell compartment in association with vesicle-like structures. In this study we identified the specific signals necessary for the correct timing of expression and to direct SEP proteins to the vacuolar membrane and to the host cell compartments.The second part of the work was carried out in Montpellier II University and aims to identify the localization of two RBC membrane skeleton components, dematin and adducin, during Plasmodium falciparum infection. Our purpose is to recognize a possible mechanism of internalization of host cytoskeleton components to the parasite compartments. In fact, IFA experiments carried on iRBCs showed that dematin and adducin start to be internalized at trophozoite stage and localize at the periphery of the parasite, most probably at the parasitophoruos vacuole (PV) membrane/lumen. Dematin and adducin internalization during Plasmodium infection is also demonstrated by subcellular fractionation and proteinase K assay: while dematin is fully internalized, adducin is partially protected and suggesting a localization of the protein at the periphery of the parasite where it can be exposed to PK degradation.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Proteom Analyse und funktionelle Charakterisierung von "Lipid Rafts" in extraparasitären Kompartimenten von Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten

Des microdomaines membranaires appelés lipid rafts et définis comme résistant aux détergents à froid (DRM), sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que l'invasion par des pathogènes, le traffic de protéines ou encore des voies de signalisation. Nous avons entrepris une étude protéomique de ces domaines DRM extraits d'érythrocytes infectés par l'agent du paludisme humain, Plasmodium falciparum dans le but de préciser quelles membranes de l'érythrocyte infecté contiennent de tels domaines et d'élucider leur rôle dans le développement intraérythrocytaire du parasite. Les résultats ont été validés par la localisation et l'association à des domaines rafts de 9 protéines jusqu'alors non caractérisées. Ils permettent de conclure que des domaines rafts sont présents comme attendu dans la membrane plasmique érythroctaire et la membrane de la vacuole parasitophore mais aussi dans des compartiments tels que les structures de Maurer exportés par le parasite dans le cytoplasme de sa cellule hôte. Deux protéines ont été étudiées de manière plus approfondie. La protéine PfN201 qui est fortement enrichie dans des DRMs. Cette protéine est localisée dans des DRMs de la membrane de la vacuole parasitophore. Elle est sécréte sous une forme soluble avec la masse moléculaire attendue et assemblée en une protéine de 250 kDa au niveau de domaines rafts. La protéine PfB985 est une protéine de la famille des protéines PfMC-2TM exportées aux structures de Maurer. Ces protéines présentent entre elles plus de 90% d'identité et, suite à l'étiquetage de 4 d'entre elles par la GFP ou par un peptide HA, nous avons montré l'existence de deux sous familles de localisation subcellulaire légèrement différente et différant par une insertion de 5 acides aminés. Nous avons également montré que ces protéines sont phosphorylées et que leur phosphorylation peut jouer un rôle central dans l'efficacité de leur export au cytoplasme érythrocytaire.Detergent Resistant Membranes (DRM) or "lipid rafts" are special microdomains in the plasma membrane and in membranes of intracellular compartments. They have been shown to be implicated in many cellular processes, like pathogen invasion, membrane sorting and signalling events. In this study, we applied a proteomic approach of DRM from erythrocytes infected with the causal agent of malaria, Plasmodium falciparum, in order to identify which membranes contain DRM and to elucidate their function during the erythrocytic development of the parasite. The results were validated through the localization and association with DRMs of nine previously uncharacterised proteins. We could show that DRM are present as expected in the erythrocyte plasma- and the parasitophorous vacuole membrane, but also in compartments that are formed by the parasite in the host cell cytoplasm, like the Maurer's cleft. Two proteins were studied in detail. PfN201 is highly enriched in DRMs and localized to DRM of the parasitophorous vacuole membrane. The protein is secreted in a soluble form with the expected molecular mass and assembled into a protein of 250 kDa in DRMs. PfB985 is a member of the protein family PfMC-2TM, which are exported to the Maurer's clefts. These proteins are more than 90% identical. Generation of transgenic parasites expressing GFP- or epitope-tagged version of four PfMC-2TM proteins allowed identifying two sub-families that differ in their subcellular localization and in the presence of a five amino acid insertion. We also showed that these proteins are phosphorylated and that their phosphorylation might play a central role in the efficiency of their export to the erythrocyte cytoplasmMONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceGermanyFRD

Human erythrocyte remodelling during Plasmodium falciparum malaria parasite growth and egress

The intra-erythrocyte growth and survival of the malarial parasite Plasmodium falciparum is responsible for both uncomplicated and severe malaria cases and depends on the parasite's ability to remodel its host cell. Host cell remodelling has several functions for the parasite, such as acquiring nutrients from the extracellular milieu because of the loss of membrane transporters upon erythrocyte differentiation, avoiding splenic clearance by conferring cytoadhesive properties to the infected erythrocyte, escaping the host immune response by exporting antigenically variant proteins at the red blood cell surface. In addition, parasite-induced changes at the red blood cell membrane and sub-membrane skeleton are also necessary for the efficient release of the parasite progeny from the host cell. Here we review these cellular and molecular changes, which might not only sustain parasite growth but also prepare, at a very early stage, the last step of egress from the host cell