Identification et caractérisation de modulateurs naturels et synthétiques du facteur de transcription AIBZIP

Androgen-induced bZIP (AlbZIP) a été identifié au début des années 2000 dans le cadre d'une étude visant à identifier des gènes régulés par les androgènes. Chez l'homme, ce facteur est très abondant au niveau de la prostate et présente une expression beaucoup plus importante au niveau des cellules cancéreuses prostatiques. L'analyse de la structure d'AIbZIP a révélé la présence d'un domaine bZIP. Ce domaine constitue la signature de la famille ATF/CREB, d'où l'appartenance d'AIbZIP à cette famille. Durant la dernière décennie, 4 autres membres de la famille ATF/CREB ont été découverts et, avec AlbZIP, ils constituent la sous-famille de CREB3. Au-delà de l'homologie observée entre leurs domaines bZIP, les membres de cette sous-famille sont impliqués dans le stress du reticulum endoplasmique (RE). AlbZIP est une protéine transmembranaire de type II localisée au RE sous sa forme inactive. En effet, la protéine AlbZIP pleine longueur est ancrée à la membrane du reticulum endoplasmique via son domaine transmembranaire et orientée de sorte que son domaine C-terminal se trouve dans la lumière du RE alors que son domaine N-terminal est projeté dans le cytoplasme. Des expériences réalisées par notre équipe ont montré qu'AlbZIP est régulée par le mécanisme RIP. En effet, suite à l'altération des concentrations calciques, nous observons la migration de la forme pleine longueur d'AIbZIP vers l'appareil de golgi où elle va subir un clivage protéolytique par les proteases SIP et S2P. La forme active libérée migre au noyau où elle va réguler l'expression de ses gènes cible via les éléments de réponse UPRE et ERSEII. Lors de mes études doctorales, j'ai tenté de déterminer comment AlbZIP est impliquée dans le stress du RE des cellules prostatiques cancéreuses et quels sont les mécanismes impliqués dans son activation et dans la régulation de ses gènes cibles. Dans un premier temps, j'ai tenté d'inhiber l'activité transcriptionnelle d'AIbZIP. Pour ce faire, j'ai généré et caractérisé un dominant négatif en utilisant l'algorithme développé par Mason et collaborateurs. Ce dominant négatif est capable de lier la forme nucléaire d'AIbZIP de type sauvage, de l'empêcher de lier les éléments de réponse et par conséquent d'inhiber son activité transcriptionnelle. J'ai tenté, dans un deuxième temps, d'identifier les partenaires de la forme pleine longueur d'AIbZIP, quand celle-ci se trouve au RE. Dans le but de mieux comprendre le mécanisme d'action impliqué dans l'activation d'AIbZIP, il était nécessaire de connaître les partenaires d'AIbZIP au RE. Grâce à cette étude, plusieurs protéines ont été identifiées. Ces protéines sont localisées au RE ou à l'appareil de golgi. Elles sont transmembranaires ou solubles et peuvent être impliquées dans la rétention d'AIbZIP au RE ou dans son transport vers les autres organites. Dans un troisième temps, j'ai tenté d'identifier les partenaires de la forme nucléaire d'AIbZIP. WD repeat domain 5 (WDR5) est une des partenaires d'AIbZIP au noyau. WDR5 présente 7 répétitions WD40 formant une structure rigide nécessaire pour les interactions protéine-protéine. De plus, elle est impliquée dans la tri-méthylation de l'histone H3. En réponse au stress du RE déclenché par une depletion des concentrations calciques, AlbZIP est activée par le mécanisme RIP. Une fois au noyau, la forme active d'AIbZIP, sous forme de dimères, recrute WDR5 au niveau de l'ADN. Ce recrutement est nécessaire pour modifier la chromatine, la rendre accessible à la machinerie de la transcription et par conséquent activer l'expression des gènes cibles d'AIbZIP. Ensemble, toutes ces données permetteront de mieux comprendre la régulation d'AIbZIP et la régulation de ses gènes cibles et ainsi cerner son rôle dans la réponse au stress du RE dans les cellules cancéreuses prostatiques humaines

Sex‐specific changes in amyloidosis and neuro‐immune modulation in response to alterations in the gut microbiome

BackgroundMicroglia, resident macrophages of CNS constantly screen the brain and engage in pathological processes by changing their morphology, expressing various antigens and become phagocytic. This activation causes the release of a wave of chemical mediators that promote the neuroinflammatory milieu. Thus, microglial homeostasis represents a highly plastic multifaceted response, finely tuned by the nature of the stimulus and the molecular repertoire involved. Studies from Sisodia lab have shown that antibiotic (ABX) mediated alterations of the gut microbiome in Thy1‐APPSwe.PS1L166Pmice (APPPS1‐21), resulted in a significant decrease in amyloidosis and altered microglial phenotypes in male mice. To investigate the influence of gut microbiome in modulating microglial function in a sex‐specific manner, we generated transgenic mice that would allow us to assess microglial RNA‐Protein networks and address the molecular mechanisms of CNS immunomodulation.MethodWe generated ‘Thy1‐APP.PS1‐RiboTag’ by crossing APPPS1‐21 mice to RiboTag mice wherein a CD11b promoter drives expression of ribosomal protein L10a (RpL10) that is fused to FLAG/EGFP at the amino‐terminus. Using our established protocol, we altered the microbiome of male and female mice (n=12) by orally gavaging them with ABX from day 14‐21, followed by low dose ABX in drinking water till they are sacrificed (7 wks). Vehicle treated mice were used as controls along with WT‐RiboTag mice. Immunoprecipitation of cortical homogenates with anti‐FLAG was performed to pull‐down actively translated mRNA and proteome in microglia following histopathology.ResultWe evaluated Aβ pathology and found that ABX‐treatment led to reduced amyloidosis in male mice with no significant changes in the female. Analysis of the mRNAs and the newly synthesized peptides resulted in a snapshot of the dynamic translational state of microglial ribosomes. We observed 21 upregulated and 22 downregulated proteins between the WT‐RiboTag and Th1‐APP.PS1‐RiboTag in male mice and 16 upregulated and 70 downregulated in female. Abx treatment resulted in upregulation of 39 and downregulation of 37 proteins in males while the females showed 51 and 9 respectively.ConclusionWe find marked differences in the mRNA and proteins associated with microglial phenotypes expressed in a sex‐specific manner as a function of changes in the gut microbiome.Peer Reviewedhttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/163849/1/alz045243.pd