Expression des microARN pendant le développement de la glande mammaire ovine adulte

National audienceIntroduction : La glande mammaire subit de nombreux remodelages durant la gestation et la lactation mettant en œuvre de nombreux processus cellulaires (i.e. prolifération et différenciation cellulaire, apoptose...). Ces processus sont sous le contrôle de nombreux types de régulateurs, notamment les microARN (miRNA). Résultats: Après construction d’une banque de miRNA dans la glande mammaire ovine en début de gestation, nous avons cloné 54 nouveaux miRNA jamais décrits chez le mouton. Les séquences de ces miRNA sont très conservées par rapport à leur équivalent chez la vache, la souris ou l’homme. Ces résultats ont été complétés par une étude suivant l’expression des miRNA pendant le développement de la glande mammaire ovine adulte, en utilisant la technique de microarray. Nous avons montré qu’une centaine de miRNA est régulée suivant trois principaux profils d’expression: une baisse d’expression pendant la gestation et la lactation, un pic d’expression pendant la gestation ou une augmentation progressive d’expression à partir de la fin de gestation et au cours de la lactation. L’accumulation d’un miRNA représentatif de chacun de ces profils (respectivement miR-21, miR-205 et miR-200b) a été suivie par hybridation in situ à plusieurs stades du développement de la glande mammaire ovine. MiR-21 et miR-200b ont été détectés dans les cellules épithéliales luminales, alors que miR-205, quant à lui, l’a été dans des cellules basales pendant la première moitié de la gestation puis dans les cellules luminales pendant la deuxième moitié. Conclusion: Nos résultats décrivent une forte expression de miR-21 dans la glande mammaire pendant la gestation précoce, période correspondant à une prolifération cellulaire intense. Par ailleurs, nous montrons que miR-205 commence à être exprimé dans les cellules luminales pendant la seconde moitié de la gestation, alors que miR-200b est déjà présent dans ces cellules. Ces deux miRNA pourraient ainsi coopérer, comme cela a déjà été décrit dans une lignée cellulaire épithéliale (MDCK), notamment afin de maintenir le statut épithélial de ces cellules en réprimant un programme comparable à l’EMT (transition epithélio-mésenchymateuse) de façon à atteindre puis préserver le phénotype sécrétoire des cellules épithéliales mammaires. Perspectives : Afin de déterminer l’implication de ces miRNA dans ces régulations, nous envisageons de bloquer l’action de ces miRNA dans un modèle de dédifférenciation cellulaire (acini mammaires de souris en culture in vitro), puis de suivre la morphologie de ces cellules ainsi que l’expression de marqueurs épithéliaux et mésenchymaux

MicroRNA in the ovine mammary gland during early pregnancy: spatial and temporal expression of miR-21, miR-205, and miR-200

The mammary gland undergoes extensive remodeling between the beginning of pregnancy and lactation; this involves cellular processes including cell proliferation, differentiation, and apoptosis, all of which are under the control of numerous regulators. To unravel the role played by miRNA, we describe here 47 new ovine miRNA cloned from mammary gland in early pregnancy displaying strong similarities with those already identified in the cow, human, or mouse. A microarray study of miRNA variations in the adult ovine mammary gland during pregnancy and lactation showed that 100 miRNA are regulated according to three principal patterns of expression: a decrease in early pregnancy, a peak at midpregnancy, or an increase throughout late pregnancy and lactation. One miRNA displaying each pattern (miR-21, miR-205, and miR-200b) was analyzed by qRT-PCR. Variations in expression were confirmed for all three miRNA. Using in situ hybridization, we detected both miR-21 and miR-200 in luminal mammary epithelial cells when expressed, whereas miR-205 was expressed in basal cells during the first half of pregnancy and then in luminal cells during the second half. We therefore conclude that miR-21 is strongly expressed in the luminal cells of the normal mammary gland during early pregnancy when extensive cell proliferation occurs. In addition, we show that miR-205 and miR-200 are coexpressed in luminal cells, but only during the second half of pregnancy. These two miRNA may cooperate to maintain epithelial status by repressing an EMT-like program, to achieve and preserve the secretory phenotype of mammary epithelial cells

Localisation de microARN et organisation nucléaire dans le tissu mammaire de vache et notamment les cellules progénitrices

National audienceLa glande mammaire se développe de manière cyclique à partir de cellules souches et progénitrices, en réponse à une régulation hormonale complexe. Plusieurs articles ont souligné le rôle que pouvaient jouer les microARN à la fois dans le maintien et la maturation des cellules souches. L’organisation spatiale du noyau, qui participe à la régulation l’expression des gènes et change au cours de la différenciation, n’a pas encore été étudiée dans ces cellules. Chez la génisse, les cellules progénitrices de la glande mammaire peuvent être identifiées sur les coupes de tissu par coloration à la fuchsine basique. Nous avons mis au point la détection de microARN par hybridation in situ sur cryo-coupes à l’aide de sondes oligonucléotidiques modifiées. L’expression de plusieurs microARN, notamment miR-21 et miR-205, a été étudiée au cours du développement de la glande mammaire de la vache et de la brebis. Mir-21 est un microARN oncogénique (oncomir) fortement exprimé dans de nombreux cancers et notamment les cancers du sein. MiR-205 a été montré par plusieurs équipes comme étant fortement exprimé dans les progénitrices mammaires chez la souris. Parallèlement, nous avons utilisé l’immunofluorescence sur cryo-coupes pour localiser les compartiments nucléaires, notamment les domaines d’hétérochromatine potentiellement impliqués dans l’épigénétique des cellules progénitrices. Nous avons montré qu’un simple marquage de l’ADN au DAPI permettait de distinguer les cellules progénitrices des cellules épithéliales en cours de différenciation, sur la base de la forme et de l’organisation interne des noyaux. L’identification des types cellulaires est optimale lorsque le tissu est inclus en paraffine. Les conditions d’hybridation in situ et d’immunofluorescence sont en cours d’optimisation afin d’examiner l’expression des microARN et l’organisation des noyaux à partir des coupes de tissu mammaire de génisse préparées avec cette méthode d’inclusion