Moonlighting chaperone activity of the enzyme PqsE contributes to RhlR-controlled virulence of Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa is a major cause of nosocomial infections and also leads to severe exacerbations in cystic fibrosis or chronic obstructive pulmonary disease. Three intertwined quorum sensing systems control virulence of P. aeruginosa, with the rhl circuit playing the leading role in late and chronic infections. The majority of traits controlled by rhl transcription factor RhlR depend on PqsE, a dispensable thioesterase in Pseudomonas Quinolone Signal (PQS) biosynthesis that interferes with RhlR through an enigmatic mechanism likely involving direct interaction of both proteins. Here we show that PqsE and RhlR form a 2:2 protein complex that, together with RhlR agonist N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL), solubilizes RhlR and thereby renders the otherwise insoluble transcription factor active. We determine crystal structures of the complex and identify residues essential for the interaction. To corroborate the chaperone-like activity of PqsE, we design stability-optimized variants of RhlR that bypass the need for C4-HSL and PqsE in activating PqsE/RhlR-controlled processes of P. aeruginosa. Together, our data provide insight into the unique regulatory role of PqsE and lay groundwork for developing new P. aeruginosa-specific pharmaceuticals

Studies on the stabilization of the transcription factor RhlR by the thioesterase PqsE in Pseudomonas aeruginosa

Eine der größten medizinischen Herausforderungen des 21. Jahrhunderts ist das vermehrte Vorkommen von pathogenen Bakterien, welche nicht durch bereits bekannte Antibiotika behandelt werden können. Infektionen mit derartigen multiresistenten Bakterien gehen mit einer verlängerten Morbidität, einer erhöhten Mortalität sowie enormen ökonomischen Herausforderungen einher. Eines der bekanntesten Bakterien mit hoher intrinsischer Resistenz gegen gebräuchlich verwendete Antibiotika ist das opportunistische Humanpathogen Pseudomonas aeruginosa, welches insbesondere bei Menschen mit kompromittiertem Immunsystem oder cystischer Fibrose schwere persistierende Infektionen verursachen kann. Insbesondere das weitreichende Arsenal an Virulenzfaktoren von P. aeruginosa sowie die Bildung von resistenten Biofilmen komplizieren eine erfolgreiche Behandlung. Die Bildung von Biofilmen sowie die Produktion von Virulenzfaktoren wird durch einen hochkomplexen Zell-Zell-Kommunikationsprozess gesteuert, welcher als Quorum sensing bezeichnet wird. Ein wesentlicher Regulator dieses Prozesses ist der Transkriptionsfaktor RhlR, welcher für die Produktion verschiedener wichtiger Virulenzfaktoren insbesondere bei chronischen Infektionen mit P. aeruginosa von großer Bedeutung ist. In seiner Aktivität ist RhlR jedoch weitestgehend von der Bindung des niedermolekularen Liganden C4-HSL sowie von der Thioesterase PqsE abhängig, deren katalytische Funktion jedoch nicht für die RhlR regulierende Funktion essenziell ist. Innerhalb dieser Arbeit konnte durch biochemische, biophysikalische wie auch strukturbiologische Methoden eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen RhlR und PqsE als Mechanismus beschrieben werden, welcher den ansonsten instabilen Transkriptionsfaktor RhlR in einer aktiven Form synergistisch mit dem niedermolekularen Liganden C4-HSL in vivo stabilisiert. PqsE besitzt folglich neben seiner Funktion als Thioesterase auch eine zweite unabhängige Funktion, welche der Aktivität eines Chaperons des Holdase Typs ähnelt. Da RhlR in seiner Stabilität und somit auch Aktivität von der Interaktion mit PqsE abhängig ist und RhlR für die Produktion vieler Virulenzfaktoren notwendig ist, stellt die PqsE-RhlR Interaktion folglich einen potenziellen Angriffspunkt für neuartige Wirkstoffe dar, durch welche die Virulenz von P. aeruginosa reduziert werden könnte, ohne dabei einen positiven Selektionsdruck auf die Entwicklung neuer Resistenzen zu verursachen.One of the greatest medical challenges of the 21st century is the increasing prevalence of pathogenic bacteria that cannot be treated with known antibiotics. Infections with these so-called multidrug-resistant (MDR) bacteria are associated with prolonged morbidity, increased mortality, and enormous economic challenges. One of the most well-known bacteria with a high intrinsic resistance to commonly used antibiotics is the opportunistic human pathogen Pseudomonas aeruginosa, which can cause severe persistent infections, especially in people with compromised immune systems or cystic fibrosis. In particular, the wide range of virulence factors of P. aeruginosa and the formation of resistant biofilms often hinder successful treatments of P. aeruginosa infections. The formation of biofilms and the production of virulence factors are controlled by a highly complex and intertwined cell-cell communication process called "Quorum sensing." A key regulator of this process is the transcription factor RhlR, which is essential for the production of various important virulence factors, especially in chronic P. aeruginosa infections. The activity of RhlR is dependent on the binding of a low-molecular-weight ligand called C4-HSL, although the thioesterase PqsE is also required for the full activation of RhlR. However, the catalytic function of PqsE is not essential for the regulation of RhlR. Within this work, a direct protein-protein interaction between RhlR and PqsE that regulates the stability of RhlR was identified and investigated using biochemical, biophysical, and structural biological methods. This mechanism stabilizes the otherwise unstable transcription factor RhlR in an active form in vivo synergistically with the low-molecular-weight ligand C4-HSL. PqsE therefore has, in addition to its function as a thioesterase, a second independent function (a so-called "moonlighting activity") that resembles the activity of a holdase-type chaperone. Since the stability of RhlR and thus also its activity is dependent on the interaction with PqsE, and RhlR is necessary for the production of many virulence factors, the PqsE-RhlR interaction therefore represents a potential drug target for the development of novel drugs that could reduce the Quorum sensing-dependent virulence of P. aeruginosa