Bacterial mechanosensitive channels:what we can learn from a simple model system, when we design it to be more complicated

In sommige kanaaleiwitten van de celmembraan is het oppervlak van de porie waterafstotend. Daardoor kan de porie, hoewel fysiek openstaand, toch ontoegankelijk zijn. Jan Peter Birkner deed onderzoek naar deze zogenaamde hydrophobic gating eigenschap bij het kanaaleiwit MscL uit de bacterie Escherichia coli. In alle vormen van het leven zijn vloeistofstromen van groot belang; macroscopische stromen, zoals bijvoorbeeld het bloed in onze aderen of water in planten, maar ook microscopische stromen, zoals langs het grensvlak van een enkele cel of door kanaaleiwitten in de celmembraan. Als we inzoomen op deze kanaaleiwitten, zien we dat er op nanometerschaal andere fysische beperkingen zijn voor vloeistofstromen dan de beperkingen op macroscopisch niveau. In diverse kanaaleiwitten (KcsA, nAChR, MscL) is het oppervlak van de nauwe porie sterk waterafstotend. Hoewel moleculen er theoretisch qua grootte wel doorheen moeten kunnen, worden ze door het waterafstotende karakter van de porie toch geblokkeerd. Deze fysiek open, maar biologisch gesloten waterafstotende regio regelt de inkomende en uitgaande stofstroom door middel van een mechanisme dat men “hydrophobic gating” noemt. Het proefschrift van Birkner gaat voornamelijk over een door hem ontwikkelde nieuwe methode waarmee het mogelijk is individuele sub-eenheden van het kanaaleiwit MscL uit de bacterie E. coli te onderzoeken en te manipuleren. Hoewel het kanaaleiwit eigenlijk is opgebouwd uit vijf identieke sub-eenheden, was Birkner met behulp van deze techniek in staat om geleidelijk het waterafstotende karakter van de porie te veranderen door één voor één de sub-eenheden aan te passen en zo het proces van hydrophobic gating heel nauwkeurig bestuderen. Birkner slaagder erin experimenteel aan te tonen dat zowel het openen en sluiten van het kanaal volledig gemoduleerd wordt door slechts een deel van een enkele sub-eenheid en dat een minimale verandering in het waterafstotende karakter van de porie al voldoende is om het kanaaleiwit te openen. Daarom lijkt dit mechanisme ideaal voor een snelle reactie op veranderende omstandigheden. Bovendien bleek dat de vijf identieke sub-eenheden tijdens de overgang van een gesloten naar een geopend kanaaleiwit asymmetrisch bewegen

Bacterial mechanosensitive channels : what we can learn from a simple model system, when we design it to be more complicated

In sommige kanaaleiwitten van de celmembraan is het oppervlak van de porie waterafstotend. Daardoor kan de porie, hoewel fysiek openstaand, toch ontoegankelijk zijn. Jan Peter Birkner deed onderzoek naar deze zogenaamde hydrophobic gating eigenschap bij het kanaaleiwit MscL uit de bacterie Escherichia coli. In alle vormen van het leven zijn vloeistofstromen van groot belang; macroscopische stromen, zoals bijvoorbeeld het bloed in onze aderen of water in planten, maar ook microscopische stromen, zoals langs het grensvlak van een enkele cel of door kanaaleiwitten in de celmembraan. Als we inzoomen op deze kanaaleiwitten, zien we dat er op nanometerschaal andere fysische beperkingen zijn voor vloeistofstromen dan de beperkingen op macroscopisch niveau. In diverse kanaaleiwitten (KcsA, nAChR, MscL) is het oppervlak van de nauwe porie sterk waterafstotend. Hoewel moleculen er theoretisch qua grootte wel doorheen moeten kunnen, worden ze door het waterafstotende karakter van de porie toch geblokkeerd. Deze fysiek open, maar biologisch gesloten waterafstotende regio regelt de inkomende en uitgaande stofstroom door middel van een mechanisme dat men “hydrophobic gating” noemt. Het proefschrift van Birkner gaat voornamelijk over een door hem ontwikkelde nieuwe methode waarmee het mogelijk is individuele sub-eenheden van het kanaaleiwit MscL uit de bacterie E. coli te onderzoeken en te manipuleren. Hoewel het kanaaleiwit eigenlijk is opgebouwd uit vijf identieke sub-eenheden, was Birkner met behulp van deze techniek in staat om geleidelijk het waterafstotende karakter van de porie te veranderen door één voor één de sub-eenheden aan te passen en zo het proces van hydrophobic gating heel nauwkeurig bestuderen. Birkner slaagder erin experimenteel aan te tonen dat zowel het openen en sluiten van het kanaal volledig gemoduleerd wordt door slechts een deel van een enkele sub-eenheid en dat een minimale verandering in het waterafstotende karakter van de porie al voldoende is om het kanaaleiwit te openen. Daarom lijkt dit mechanisme ideaal voor een snelle reactie op veranderende omstandigheden. Bovendien bleek dat de vijf identieke sub-eenheden tijdens de overgang van een gesloten naar een geopend kanaaleiwit asymmetrisch bewegen. In all kingdoms of life there are substances flowing: macroscopic streams, like blood in our arteries and veins, or water in plants, but also microscopic ones, like occurring at the interface of a single cell or within membrane channels. When we zoom-in to the latter, to the nanometer scaled ion channels and solute pores of biological membranes, we face barriers for the flow beyond obvious physical restrictions. In the narrow confinements as found in various ion channels (KcsA, nAChR, MscL), hydrophobic entities provide a strong barrier to the flow of water and ions across cellular membranes even though their geometry would theoretically not block it. These physically open, but biologically closed hydrophobic motifs are thought to maintain the inward and outward traffic through ion channels by a mechanism designated hydrophobic gating. In my thesis, we report on our new method that allows single-subunit resolution for manipulating and monitoring of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. We gradually changed the hydrophobicity of the pore constriction in this homopentameric protein by modifying a critical pore residue one subunit at a time. Our experimental results suggest that both the channel opening and closing are initiated by one helix of a single subunit and that the participation of each of the five identical subunits to the structural transitions between the closed and open states is asymmetrical. The minimal change in pore hydrophobicity required for gating seems ideal for a fast and energy-efficient response to the changes in the membrane tension.

The activation mode of the mechanosensitive ion channel, MscL, by lysophosphatidylcholine differs from tension-induced gating

One of the best-studied mechanosensitive channels is the mechanosensitive channel of large conductance (MscL). MscL senses tension in the membrane evoked by an osmotic down shock and directly couples it to large conformational changes leading to the opening of the channel. Spectroscopic techniques offer unique possibilities to monitor these conformational changes if it were possible to generate tension in the lipid bilayer, the native environment of MscL, during the measurements. To this end, asymmetric insertion of L-alpha-lysophosphatidylcholine (LPC) into the lipid bilayer has been effective; however, how LPC activates MscL is not fully understood. Here, the effects of LPC on tension-sensitive mutants of a bacterial MscL and on MscL homologs with different tension sensitivities are reported, leading to the conclusion that the mode of action of LPC is different from that of applied tension. Our results imply that LPC shifts the free energy of gating by interfering with MscL-membrane coupling. Furthermore, we demonstrate that the fine-tuned addition of LPC can be used for controlled activation of MscL in spectroscopic studies

Lipids activate SecA for high affinity binding to the SecYEG complex

Protein translocation across the bacterial cytoplasmic membrane is an essential process catalyzed predominantly by the Sec translocase. This system consists of the membrane-embedded protein-conducting channel SecYEG, the motor ATPase SecA, and the heterotrimeric SecDFyajC membrane protein complex. Previous studies suggest that anionic lipids are essential for SecA activity and that the N-terminus of SecA is capable of penetrating the lipid bilayer. The role of lipid binding, however, has remained elusive. By employing differently sized nanodiscs reconstituted with single SecYEG complexes and comprising varying amounts of lipids, we establish that SecA gains access to the SecYEG complex via a lipid-bound intermediate state, whilst acidic phospholipids allosterically activate SecA for ATP-dependent protein translocation

Studying mechanosensitive ion channels with an automated patch clamp

Patch clamp electrophysiology is the main technique to study mechanosensitive ion channels (MSCs), however, conventional patch clamping is laborious and success and output depends on the skills of the operator. Even though automated patch systems solve these problems for other ion channels, they could not be applied to MSCs. Here, we report on activation and single channel analysis of a bacterial mechanosensitive ion channel using an automated patch clamp system. With the automated system, we could patch not only giant unilamellar liposomes but also giant Escherichia coli (E. coli) spheroplasts. The tension sensitivity and channel kinetics data obtained in the automated system were in good agreement with that obtained from the conventional patch clamp. The findings will pave the way to high throughput fundamental and drug screening studies on mechanosensitive ion channels.

Characteristics and outcomes of SARS-CoV-2 breakthrough infections among double-vaccinated and triple-vaccinated patients with inflammatory rheumatic diseases

Objective To analyse the clinical profile of SARS-CoV-2 breakthrough infections in at least double-vaccinated patients with inflammatory rheumatic diseases (IRDs).Methods Data from the physician-reported German COVID-19-IRD registry collected between February 2021 and July 2022 were analysed. SARS-CoV-2 cases were stratified according to patients’ vaccination status as being not vaccinated, double-vaccinated or triple-vaccinated prior to SARS-CoV-2 infection and descriptively compared. Independent associations between demographic and disease features and outcome of breakthrough infections were estimated by multivariable logistic regression.Results In total, 2314 cases were included in the analysis (unvaccinated n=923, double-vaccinated n=551, triple-vaccinated n=803, quadruple-vaccinated n=37). SARS-CoV-2 infections occurred after a median of 151 (range 14–347) days in patients being double-vaccinated, and after 88 (range 14–270) days in those with a third vaccination. Hospitalisation was required in 15% of unvaccinated, 8% of double-vaccinated and 3% of triple-vaccinated/quadruple-vaccinated patients (p<0.001). Mortality was 2% in unvaccinated, 1.8% in the double-vaccinated and 0.6% in triple-vaccinated patients. Compared with unvaccinated patients, double-vaccinated (OR 0.43, 95% CI 0.29 to 0.62) and triple-vaccinated (OR 0.13, 95% CI 0.08 to 0.21) patients showed a significant lower risk of COVID-19-related hospitalisation. Using multivariable analysis, the third vaccination was significantly associated with a lower risk for COVID-19-related death (OR 0.26; 95% CI 0.01 to 0.73).Conclusions Our cross-sectional data of COVID-19 infections in patients with IRD showed a significant reduction of hospitalisation due to infection in double-vaccinated or triple-vaccinated patients compared with those without vaccination and even a significant reduction of COVID-19-related deaths in triple-vaccinated patients. These data strongly support the beneficial effect of COVID-19 vaccination in patients with IRD.Trial registration number EuDRACT 2020-001958-21