Stromal fibroblasts shape the myeloid phenotype in normal colon and colorectal cancer and induce CD163 and CCL2 expression in macrophages

Colorectal cancer (CRC) accounts for about 10% of cancer deaths worldwide. Colon carcinogenesis is critically influenced by the tumor microenvironment. Cancer associated fibroblasts (CAFs) and tumor associated macrophages (TAMs) represent the major components of the tumor microenvironment. TAMs promote tumor progression, angiogenesis and tissue remodeling. However, the impact of the molecular crosstalk of tumor cells (TCs) with CAFs and macrophages on monocyte recruitment and their phenotypic conversion is not known in detail so far. In a 3D human organotypic CRC model, we show that CAFs and normal colonic fibroblasts are critically involved in monocyte recruitment and for the establishment of a macrophage phenotype, characterized by high CD163 expression. This is in line with the steady recruitment and differentiation of monocytes to immunosuppressive macrophages in the normal colon. Cytokine profiling revealed that CAFs produce M-CSF, and IL6, IL8, HGF and CCL2 secretion was specifically induced by CAFs in co-cultures with macrophages. Moreover, macrophage/CAF/TCs co-cultures increased TC invasion. We demonstrate that CAFs and macrophages are the major producers of CCL2 and, upon co-culture, increase their CCL2 production twofold and 40-fold, respectively. CAFs and macrophages expressing high CCL2 were also found in vivo in CRC, strongly supporting our findings. CCL2, CCR2, CSF1R and CD163 expression in macrophages was dependent on active MCSFR signaling as shown by M-CSFR inhibition. These results indicate that colon fibroblasts and not TCs are the major cellular component, recruiting and dictating the fate of infiltrated monocytes towards a specific macrophage population, characterized by high CD163 expression and CCL2 production

Cancer associated fibroblast to myeloid cell communication and its impact on differentiation and polarization of macrophages in colorectal cancer

Das kolorektale Karzinom gehört mit hohen Inzidenz- und Mortalitätsraten zu den häufigsten Krebserkrankungen der Welt. In den letzten Jahrzenten wurden zahlreiche Umweltfaktoren und mutierte Gene mit dessen Entstehung und Entwicklung assoziiert. Charakteristisch für die Mikroumgebung des Tumors ist eine intensive Einwanderung von sogenannten tumor-assoziierten Fibroblasten (CAFs) und von tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs). Deren Interaktionen sind bis heute jedoch nicht vollständig geklärt. Im Blut zirkulierende Monozyten werden durch dynamische Netzwerke von chemotaktischen Faktoren zum Ort des Tumors rekrutiert, differenziert und in einen M2-ähnlichen anti-inflammatorischen Phänotyp umpolarisiert. CCL2 als eines der am häufigsten untersuchten Chemokine wird in diesem Kontext als Schlüsselfaktor angesehen. Diese Masterarbeit konzentriert sich auf die Rolle des CCL2/CCR2 und des M-CSF/M-CSFR Signalweges in der Kommunikation zwischen CAFs und Makrophagen. Wir haben gezeigt, dass 2D Kulturen mit diesen Zelltypen eine Expression von CCR2 und M-CSFR zeigen. Dies ist insofern relevant, da vergangene Forschungsarbeiten erhöhte intratumorale CCL2 Konzentrationen zeigten. Wir haben deshalb ein Durchflusszytometer-basiertes Arbeitsprotokoll etabliert, welches uns die Effekte von CCL2/CCR2 und M-CSF/M-CSFR auf CAFs und Makrophagen aus 3D Kollagen Typ 1 Gelen untersuchen lässt. Kokultivierte M-CSFR-negative/CCR2-negative/CCL2-positive CAFs zeigten keine von uns wahrnehmbaren Veränderungen durch die Behandlung mit CCR2 (RS 504393) oder M-CSFR (BLZ 945) Inhibitoren. Wir schließen deshalb einen möglichen autokrinen Effekt von CCL2 auf CAFs aus, halten jedoch einen parakrinen Effekt auf Makrophagen für wahrscheinlich. Außerdem konnten wir zeigen, dass die Deregulierung des M-CSF/M-CSFR Signalweges mittels BLZ 945 zum Verlust der CCL2 und CCR2 Expression führt, M-CSFR herunterreguliert wird und myeloische Zellen den M2-ähnlichen Makrophagen Marker CD163 verlieren. Im Gegensatz dazu führte das Blockieren des CCL2/CCR2 Signalweges mittels RS 504393 in Makrophagen zu einem kompensatorischen Anstieg der CCR2 und CCL2 Expression, was auf einen streng regulierten Rückkopplungsmechanismus hindeutet. Um die in vivo Relevanz unsere in vitro Experimente zu demonstrieren, überprüften wir die CCL2 Expression im kolorektalem Karzinom. Tatsächlich bestätigte eine Konfokal-Laser-Mikroskopie-basierte in vivo Analyse das Vorkommen CCL2 exprimierender Fibroblasten und CCL2 exprimierender Makrophagen in gesunden als auch erkrankten Patienten. Dies bekräftigt wiederum unsere Hypothese, laut welcher im kolorektalen Karzinom CCL2 grundsätzlich im Stroma exprimiert wird. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass im kolorektalen Karzinom der durch CCL2/CCR2 wirkende M-CSF/M-CSFR Signalweg eine wichtige Rolle bei der Kommunikation in der Tumorumgebung spielt.Colorectal cancer (CRC) ranks among the top three cancers in terms of incidence and mortality rates worldwide. Numerous environmental factors and mutated genes have been associated with its development and progression over the last few decades. Less understood is the interaction with its tumor microenvironment, which for the most part is infiltrated by cancer-associated fibroblasts (CAFs) and tumor-associated macrophages (TAMs). Blood-circulating monocytes are recruited to the tumor sites by dynamic networks of chemo-attractants and have been shown to differentiate and polarize into a tumor-favoring anti-inflammatory M2-like phenotype. CCL2 – one of the most studied chemokines – is believed as key player in these mechanisms. However, its regulation so far remains controversial. This thesis was focusing on the roles of CCL2/CCR2 and M-CSF/M-CSFR signaling axis in the communication between CAFs and macrophages. First, we determined CCR2 and M-CSFR expression in 2D cultured CAFs and monocytes. In the past, increased levels of intra-tumoral CCL2 were found and these elevated levels are associated with bad prognosis. We therefore established a multicolor flow cytometry workflow allowing for precise analysis of CCL2/CCR2 and M-CSF/M-CSFR interference-effects on several markers in either mono- or cocultured 3D collagen gel setups. Cocultured CAFs, which displayed no expression of CCR2, did not respond to CCR2 and M-CSFR small molecule inhibitors RS 504393 and BLZ 945, but showed high expression levels of CCL2. We therefore exclude a possible autocrine effect of CCL2 through CCR2 in CAFs and suggest a paracrine effect on macrophages. Moreover, we provide evidence that interference with the M-CSF/M-CSFR pathway by BLZ 945 resulted in loss of CCL2 and CCR2 expression, downregulation of M-CSFR and loss of the M2-like macrophage marker CD163 in the myeloid cells. On the other hand, blockage of CCL2/CCR2 signaling by RS 504393 resulted in a compensatory increase in CCR2 and CCL2 expression in the macrophages indicating a tightly regulate feedback mechanism. In addition, to demonstrate the in vivo relevance of our in vitro, we investigated CCL2 expression in colorectal cancer patients. Indeed, confocal laser scanning microscopy confirmed the presence of CCL2 expressing fibroblasts and CCL2 expressing macrophages in both healthy and tumor patient samples. This validated our hypothesis of strictly stromal derived expression of CCL2 in CRC. In summary, we show that the M-CSF/M-CSFR axis acting via CCL2/CCR2 plays an important role in the communication between cells in the tumor microenvironment and contribute to a better understanding of CRC biology