Molecular And Physiological Characterization Of Iron Resistant Saccharomyces Cerevisiae

Tez (Doktora) -- İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2016Thesis (Ph.D.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2016Yerkabuğundaki en yaygın dördüncü element olan demir, canlılar için gerekli bir element olmakla birlikte, yüksek konsantrasyonlarda canlılar üzerinde toksik etki göstermektedir. Demirin en yaygın iki oksidasyon hali (Fe+3 ve Fe+2) arasındaki elektron taşınım potansiyeli, demiri tüm canlılar için önemli kılmaktadır. Demir iyonları oksidatif fosforilasyonda da önemli rol oynar. Demir; bakır, çinko, nikel ve kobalt gibi diğer geçiş metalleri ile benzer fiziksel ve kimyasal özellikler göstermektedir. Geçiş metallerinin iyonları ortak taşınım sistemlerine sahiptir veya bazı yapılarda birbirlerinin yerini alabilir. Bu nedenle, demir direnci ile diğer geçiş metallerine olan direncin ortak özelliklerinin olması beklenebilir. Kalıtsal hemokromatozis ve anemi, demire dayalı temel hastalıklardandır. Demir ile ilgili anahtar proteinlerin mutasyonları sonucunda, bu gibi hastalıklar ortaya çıkmaktadır. Bu proteinler, demirin taşınması, algılanması, metabolize edilmesi ve kullanımı durumlarında fonksiyon gösterirler. Demir taşınımının aydınlatılması veya demirin ökaryotlarda kullanımı ve önemine dair elde edilen en ufak bir bilgi, bu hastalıkların temelinde yer alan mekanizmalara ışık tutabilir. Saccharomyces cerevisiae mayası, endüstriyel uygulamalarda ve temel bilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir mikroorganizmadır. Temel bilim araştırmalarında kullanılmasının en önemli sebepleri, en basit ökaryotik hücre modeli olması ve genetik modifikasyonunun kolaylıkla yapılabilmesidir. Endüstriyel uygulamalarda tercih edilme sebepleri ise; düşük pH değerlerinde kolaylıkla üreyebilmesi, antibiyotiklere karşı hassasiyetinin olmaması, bakterilere kıyasla toplum sağlığına olumsuz etkilerinin olmaması, yine bakterilere kıyasla daha büyük olduğu için daha kolay hasat edilebilmesi, hücre dışına sentezlenen proteinlerin saflaştırılmasının daha kolay olması ve post-translasyonal modifikasyonları yaparak istenilen konformasyonda proteini sentezleyebilmesidir. Metabolik mühendislik, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak, hücresel aktivitelerin arttırılmasını veya stres toleransı gibi hücresel özelliklerin geliştirilmesini sağlar. Bailey, 1991’de metabolik mühendisliği; hücrenin enzimatik, taşıma ve düzenleyici işlevlerinde rekombinant DNA teknolojisi ile değişiklikler yapılarak hücresel aktivitelerin iyileştirilmesi olarak tanımladı. Bu tanım, bilimsel bir disiplin olarak metabolik mühendisliğin literatürdeki ilk tanımı oldu. Mikrobiyal metabolik mühendislikte genel olarak, özellikleri geliştirilmek istenilen mikrobiyal suşa heterolog genler ve/veya suşun iyileştirilmesi için gerekli olan düzenleyici elementler kazandırılmaktadır. Metabolik mühendislik çalışmaları; belirli bir genetik manipülasyon setinin hangi hücresel işlevde istenilen değişimin elde edilmesinde etkili olduğunun belirlenmesine, uygulanmasına ve geliştirilmesine yardımcı olur. Fakat bu çalışmalarda sıkça karşılaşılan bir kısıtlama ise; bu süreçte, reaksiyona girebilecek potansiyele sahip yeni bileşiklerin ortaya çıkmasıdır. Diğer sıkça rastlanan kısıtlamalar ise; ifade edilen heterolog proteinin proteolize uğramaması, düzgün şekilde katlanması, gerekli bağlanmaların gerçekleşmesi, prostetik grubun eklenmesi, uygun şekilde konumlanması, ilgili mikroorganizmanın gerekli tüm sübstratlara erişimi ve engelleyici bir çevreye maruz kalmaması gibi gereksinimlerdir. Bailey'nin yapmış olduğu ilk metabolik mühendislik tanımı, mikrobiyal stres toleransının iyileştirilmesi gibi çalışmaları kapsamıyor izlenimi vermekteydi. Bu sebeple 1998 yılında Stephanopoulos, eski tanımın "hücresel aktiviteleri" kısmını "ürün oluşumu veya hücresel özellikler" olarak değiştirerek, daha kapsamlı bir metabolik mühendislik tanımı yaptı. Rasyonel metabolik mühendislik, iyileştirilmesi istenilen mikroorganizma hakkında detaylı biyokimyasal, genetik ve regülasyon verisi gerektirdiğinden; bu durum, özellikle hakkında fazla bilgi sahibi olunmayan, ve/veya iyileştirilmesi istenilen özelliklerinin moleküler altyapısı oldukça karmaşık olan mikroorganizmalar için uygulamada ciddi kısıtlamalara neden olabilmektedir. Bu kısıtlamaları aşmak için yine Bailey tarafından 1996'da tanımlanan tersine metabolik mühendislik yaklaşımı ise, rasyonel metabolik mühendisliğin tersten uygulanması niteliğinde olup, iyileştirilmek istenilen mikroorganizma hakkında kapsamlı bilgi sahibi olmayı gerektirmemesiyle araştırmacılara avantaj sağlamaktadır. Tersine metabolik mühendislik yaklaşımı, öncelikle heterolog bir organizmada veya ilgili bir model sistemde istenilen fenotipi tanımlamak ya da oluşturmak, ikinci olarak bu istenilen fenotip için gerekli genetik ve çevresel faktörleri tanımlamak veya ortaya çıkarmak ve son olarak da istenilen fenotipi istenilen organizmaya aktararak uygulamayı kapsar. Bu çalışmanın amacı; bir tersine metabolik mühendislik stratejisi olan evrimsel mühendislik ile daha önce elde edilmiş olan, demire dirençli Saccharomyces cerevisiae mutant mayasının moleküler ve fizyolojik yönden karakterize edilmesi ve böylelikle demir direncinin karmaşık moleküler altyapısının incelenmesidir. Bu amaçla, demire dirençli suşun diğer stres türlerine (özellikle de diğer geçiş metal iyonlarına) karşı çapraz direnci detaylı olarak belirlenmiştir. Fizyolojik analizler de gerçekleştirilmiş ve demire dirençli mutantın yüksek düzeyde gliserol ürettiği ve yine yüksek düzeyde trehaloz biriktirdiği gözlenmiştir. S. cerevisiae mayasının toksik metal stresi varlığında iki ana direnç mekanizması ile hayatta kalabildiği bilinmektedir: ayırma/uzaklaştırma ve kaçınma. Dirençli suşun temel demir direnç mekanizması hakkında bilgi edinmek amacıyla; Alevli Atomik Absorpsiyon Spektrofotometri (F-AAS) yöntemi ile, demir stresi varlığında ve yokluğunda mutant suşun ve referans suşun demir içerikleri belirlenmiştir. Sonuçlar, ortamda demir stresi yokken, demire dirençli maya suşunun, referans suşa kıyasla anlamlı ölçüde daha yüksek demir düzeyine sahip olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, demir stresi varlığında, demire dirençli mutant, referans suş kadar yüksek düzeyde demir iyonunu bünyesine almamıştır. Bu bulgular; demir stresi varlığında, demire dirençli mutantın demir iyonlarının hücre içine taşınımından kaçınarak hayatta kalabildiğine işaret etmektedir. Demire dirençli S. cerevisiae suşunun moleküler karakterizasyonu için, kantitatif Revers Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) ve mikroarray yöntemleri kullanılarak, demir stresi varlığında ve yokluğunda transkriptomik analizler gerçekleştirilmiştir. Mikroarray analiz sonuçları; demire dirençli S. cerevisiae suşunun oksidatif stres ile ilişkili genlerinin anlatım düzeylerinin, demir stresi yokluğunda bile, referans suşa kıyasla daha yüksek düzeyde olduğunu göstermiştir. Mikroarray analiz sonuçları doğrultusunda, lipid peroksidasyon testi ve hücre içi reaktif oksijen türü (ROS) düzeyi tespit testi gerçekleştirilmiştir. Demire dirençli suşun hücre içi ROS düzeyinin referans suşa göre daha düşük düzeyde olduğu görülmüştür. Buna göre, demire dirençli suş muhtemelen oksidatif stres ile ilişkili genlerinin anlatım düzeylerini yüksek tutarak antioksidan maddeler üretmekte, böylelikle hücre içi ROS düzeylerini düşürmekte ve yüksek düzeyde demir stresi varlığında hayatta kalabilmektedir.Iron, the fourth most abundant element in earth crust, is essential for living organisms. At high concentrations, however, it is toxic. The electron transport potential between its two most common oxidation states (Fe3+ and Fe2+) makes iron crucial for all living organisms. Iron ions play critical roles in oxidative phosphorylation. Iron shows similar physical and chemical properties with other transition metals, like copper, zinc, nickel and cobalt. Transition metal ions have common transport systems or they can replace each other in some structures. Thus, it can be expected that iron resistance and resistance to other transition metals may have common features. The aim of this study was the molecular and physiological characterization of an iron-resistant Saccharomyces cerevisiae mutant that was previously obtained by evolutionary engineering, an inverse metabolic engineering strategy. For this purpose, the cross-resistance of the iron-resistant strain against other stress types (particularly other transition metal ions) were determined in detail. Growth physiological analyses were also performed, which revealed that the iron-resistant mutant produced high levels of glycerol and accumulated high amounts of trehalose. The yeast S. cerevisiae can survive toxic metals by either of the two major kinds of resistance mechanisms: sequestration or avoidance. To gain insight into the major iron resistance mechanism in the resistant strain, iron contents of the mutant and the reference strain were determined both in the presence and absence of iron stress, by using Flame Atomic Absorption Spectrophotometry (F-AAS). The results showed that the iron-resistant yeast strain had significantly higher iron level than the reference strain, already in the absence of any iron stress. When iron stress was present in the culture medium, however, the iron-resistant mutant did not take up as much iron ions as the reference strain did. These results imply that in the presence of iron stress, the iron-resistant mutant avoids iron ion uptake, to survive iron stress conditions. For molecular characterization of the iron-resistant S. cerevisiae strain, transcriptomic analyses were performed using quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) and microarray technology, both in the presence and absence of iron stress. Microarray analysis results showed that the iron-resistant S. cerevisiae strain had higher expression levels of the oxidative stress-related genes than the reference strain, even in the absence of any iron stress. According to the results obtained by the microarray analysis, lipid peroxidation assay and intracellular reactive oxygen species (ROS) levels determination assay were performed. The intracellular ROS level of the iron-resistant strain was found to be lower than that of the reference strain. Thus, the iron-resistant strain possibly expresses high levels of oxidative stress-related genes and produces antioxidant c which reduce intracellular ROS levels. By this means, it may survive high levels of iron stress.DoktoraPh.D

Evolutionary Engineering of an Iron-Resistant Saccharomyces cerevisiae Mutant and Its Physiological and Molecular Characterization

Iron plays an essential role in all organisms and is involved in the structure of many biomolecules. It also regulates the Fenton reaction where highly reactive hydroxyl radicals occur. Iron is also important for microbial biodiversity, health and nutrition. Excessive iron levels can cause oxidative damage in cells. Saccharomyces cerevisiae evolved mechanisms to regulate its iron levels. To study the iron stress resistance in S. cerevisiae, evolutionary engineering was employed. The evolved iron stress-resistant mutant “M8FE” was analysed physiologically, transcriptomically and by whole genome re-sequencing. M8FE showed cross-resistance to other transition metals: cobalt, chromium and nickel and seemed to cope with the iron stress by both avoidance and sequestration strategies. PHO84, encoding the high-affinity phosphate transporter, was the most down-regulated gene in the mutant, and may be crucial in iron-resistance. M8FE had upregulated many oxidative stress response, reserve carbohydrate metabolism and mitophagy genes, while ribosome biogenesis genes were downregulated. As a possible result of the induced oxidative stress response genes, lower intracellular oxidation levels were observed. M8FE also had high trehalose and glycerol production levels. Genome re-sequencing analyses revealed several mutations associated with diverse cellular and metabolic processes, like cell division, phosphate-mediated signalling, cell wall integrity and multidrug transporters

Genomic, transcriptomic and physiological analyses of silver‐resistant Saccharomyces cerevisiae obtained by evolutionary engineering

International audienceSilver is a non-essential metal used in medical applications as an antimicrobial agent, but it is also toxic for biological systems. To investigate the molecular basis of silver resistance in yeast, we employed evolutionary engineering using successive batch cultures at gradually increased silver stress levels up to 0.25-mM AgNO(3)in 29 populations and obtained highly silver-resistant and genetically stableSaccharomyces cerevisiaestrains. Cross-resistance analysis results indicated that the silver-resistant mutants also gained resistance against copper and oxidative stress. Growth physiological analysis results revealed that the highly silver-resistant evolved strain 2E was not significantly inhibited by silver stress, unlike the reference strain. Genomic and transcriptomic analysis results revealed that there were mutations and/or significant changes in the expression levels of the genes involved in cell wall integrity, cellular respiration, oxidative metabolism, copper homeostasis, endocytosis and vesicular transport activities. Particularly the missense mutation in theRLM1gene encoding a transcription factor involved in the maintenance of cell wall integrity and with 707 potential gene targets might have a key role in the high silver resistance of 2E, along with its improved cell wall integrity, as confirmed by the lyticase sensitivity assay results. In conclusion, the comparative physiological, transcriptomic and genomic analysis results of the silver-resistantS. cerevisiaestrain revealed potential key factors that will help understand the complex molecular mechanisms of silver resistance in yeast