Involvement of the C terminus in intramolecular nitrogen channeling in glucosamine 6-phosphate synthase: evidence from a 1.6 å crystal structure of the isomerase domain

AbstractBackground: Glucosamine 6-phosphate synthase (GlmS) catalyses the first step in hexosamine metabolism, converting fructose-6P (6 phosphate) into glucosamine-6P using glutamine as a nitrogen source. GlmS is a bienzyme complex consisting of two domains that catalyse glutamine hydrolysis and sugar-phosphate isomerisation, respectively. Knowledge of the three-dimensional structure of GlmS is essential for understanding the general principles of catalysis by ketol isomerases and the mechanism of nitrogen transfer in glutamine amidotransferases.Results: The crystal structure of the isomerase domain of the Escherichia coli GlmS with the reaction product, glucosamine-6P, has been determined at 1.57 å resolution. It is comprised of two topologically identical subdomains, each of which is dominated by a nucleotide-binding motif of a flavodoxin type. The catalytic site is assembled by dimerisation of the protein.Conclusions: The isomerase active site of GlmS seems to be the result of evolution through gene duplication and subsequent dimerisation. Isomerisation of fructose-6P is likely to involve the formation of a Schiff base with Lys603 of the enzyme, the ring-opening step catalysed by His504, and the proton transfer from C1 to C2 of the substrate effected by Glu488. The highly conserved C-terminal fragment of the chain may play a key role in substrate binding, catalysis and communication with the glutaminase domain. The corresponding sequence pattern DXPXXLAK[SC]VT (in single-letter amino-acid code, where X is any amino acid and letters in brackets indicate that either serine or cysteine may take this position) may be considered as a fingerprint of GlmS

Chemical modification of glucosamine-6-phosphate synthase by diethyl pyrocarbonate: Evidence of histidine requirement for enzymatic activity

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Characterization of a Phosphoglucose Isomerase-like Activity Associated with the Carboxy-Terminal Domain of Escherichia coli Glucosamine-6-phosphate Synthase

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Conception & Synthèse des Agents de Contraste Intelligents Pour IRM & L'Imagerie Optique

Au cours des dernières années, l imagerie médicale est devenue l une des techniques les plus puissantes dans le domaine du diagnostic médical et des recherches biomédicales. Avec le développement de l imagerie moléculaire, les sondes sensibles permettant l imagerie multimodale des événements moléculaires sont alors nécessaires.Dans ce travail, nous présentons la conception et la synthèse des complexes de lanthanides dans le but de développer des agents de contraste intelligents pour la détection de l activité enzymatique par IRM (T1/CEST) et l imagerie optique. Les complexes conçus s articulent autour d un chélate de lanthanide macrocyclique joint avec une amino pyridine qui est liée à un déclencheur enzymatique sensible (e.g. galactoside) par un espaceur auto-immolatif. Celui-ci est censé modifier temporairement, en fonction de la présence d enzyme, les propriétés magnétiques et photo-physiques du complexe. Le concept a été validé sur un composé modèle sans déclencheur. Bien qu aucune différence de relaxation n ait été observée entre les modèles de forme enzymatique activée et non-activée qui empêche l utilisation de T1-IRM, des effets ParaCEST différents dépendant du lanthanide, ont été observé. En outre, un effet CEST inconnu a été affecté à la fonction carbamate. Des études photo-physiques préliminaires ont montré également des propriétés différentes des deux formes et ont confirmé le potentiel de ces complexes comme agents de contraste enzymatiques sensibles bimodals. La synthèse de la sonde enzymatique sensible a été tenté par trois voies différentes et a finalement été effectué dans un processus de treize étape qui restait à être optimisé. Une étude sur la relation structure-activité a été lancée avec la synthèse des isomères de position sur la pyridine du composé modèleOver the last decade, medical imaging has evolved into one of the most powerful technique in diagnostic clinical medicine and biomedical researches. With the development of molecular imaging responsive probes allowing multimodal imaging of molecular events are then required.In this work, we present the design and the synthesis of lanthanide complexes with the aim of developing smart contrast agents for the detection of enzyme activity by MRI (T1 / CEST) and Optical Imaging. The designed complexes are built around a macrocyclic lanthanide chelate appended with an amino pyridine which is linked to an enzyme-sensitive trigger (e.g. galactoside) via a self-immolative linker. The latter is supposed to modify temporarily and in an enzyme dependent way the magnetic and photo-physical properties of the complex. The concept was first validated on a model compound without trigger. Although no difference of relaxivity was observed between models of the enzyme-activated and non-activated forms precluding the use in T1-MRI, different paraCEST effects were observed and found dependent on the lanthanide. Moreover, a previously unknown CEST effect was assigned to a carbamate function. Preliminary photo-physical studies showed also a different behavior of the two forms and confirmed the potentiality of these complexes as enzyme responsive bimodal contrast agent. The synthesis of the enzyme-responsive probe has been attempted by three different pathways and was finally achieved in a thirteen-step process which remained to be optimized. A structure activity relationship study has been initiated with the synthesis of positional isomers on the pyridine of the model compoundPARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Affinity Labeling of Escherichia Coli Glucosamine-6-Phosphate Synthase with a Fructose 6-Phosphate Analog. Evidence for Proximity Between the N-Terminal Cysteine and the Fructose-6-Phosphate-Binding Site

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Discovering new inhibitors of bacterial glucosamine-6P synthase (GlmS) by docking simulations

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Arabinose-5-phosphate oxime vs its methylenephosphonate mimetic as high energy intermediate of the glucosamine-6P synthase catalyzed reaction

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Les oximes dans la recherche d'inhibiteurs de la glucosamine-6P Synthase (Synthèses, études physico-chimiques et évaluations in vitro)

La Glucosamine-6P synthase (GlmS) catalyse l étape limitante de la biosynthèse des hexosamines. Sa surexpression est à l'origine des complications liées au diabète et son inhibition constitue donc une nouvelle piste thérapeutique. Au cours de ce travail, nous avons développé des outils pour la conception de nouveaux inhibiteurs de la GlmS selon une stratégie par assemblage de fragments. Une synthèse en parallèle d'O-aryloxyamines et d'éthers d'oxime de sucres phosphates a d abord été mise au point. Un test permettant l analyse simultanée par spectrométrie de masse des deux activités de l enzyme (glutaminase et synthase) a ensuite été développé. La stéréospécificité de l interaction des deux stéréoisomères des éthers d oxime avec la protéine a enfin été étudiée par RMN en utilisant la technique de transfert de saturation (STD), ce qui a permis de mettre en évidence l existence de deux sites de fixation distincts, spécifiques de chacun des isomères.The hexosamine biosynthetic pathway is closely associated with the side effects of diabetes. The conversion of fructose-6P (Fru6P) into glucosamine-6P (GlcN6P), the rate-limiting step in this pathway, is catalyzed by glucosamine-6P synthase (GlmS). This enzyme is hence considered as a potential therapeutic target for the treatment of vascular complications linked to diabetes. During this project, we set up the necessary tools for the discovery of new specific GlmS inhibitors using a fragment-based strategy. Therefore, O-aryloxyamines and oxime ethers were prepared using parallel synthesis. A mass spectrometry assay allowing simultaneous analysis of glutaminase and synthase enzyme activities was developed. Finally, the study of the interaction between GlmS and oxime ether isomers by Saturation Transfer Difference NMR revealed for the first time the existence of two separate binding sites specific of each isomer.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Méthodologie de synthèse et applications des glycines a-hétérosubstituées

PARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Vers la conception d'inhibiteurs de la glucosamine-6P synthase par assemblage de fragments (sélection des fragments assistée par le substrat)

Une approche de type assemblage de fragments a été employée pour rechercher de nouveaux inhibiteurs de la glucosamine-6P synthase (Glms ou Gfat). Cette enzyme qui catalyse la synthèse de la glucosamine-6P à partir du fructose-6P et de la glutamine est responsable de l'étape limitante de la biosynthèse des hexosamines. Dans la stratégie envisagée, le fructose-6P a été utilisé comme plateforme reconnue par l'enzyme pour véhiculer les constituants d'une banque d'alcoxyamines vers le site actif de l'enzyme. Le criblage a ensuite consisté en un test d'inhibition de l'activité enzymatique. Les différentes étapes ayant permis l'identification d'une première série de fragments sont présentées: élaboration d'une nouvelle synthèse en parallèle et sur phase solide d'alcoxyamines, synthèse d'une banque d'éthers d'oxime du fructose-6P, mise au point d'un nouveau test enzymatique par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) et résultats du criblage enzymatique.CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF