Human Cytomegalovirus IE1 Protein Elicits a Type II Interferon-Like Host Cell Response That Depends on Activated STAT1 but Not Interferon-γ

Human cytomegalovirus (hCMV) is a highly prevalent pathogen that, upon primary infection, establishes life-long persistence in all infected individuals. Acute hCMV infections cause a variety of diseases in humans with developmental or acquired immune deficits. In addition, persistent hCMV infection may contribute to various chronic disease conditions even in immunologically normal people. The pathogenesis of hCMV disease has been frequently linked to inflammatory host immune responses triggered by virus-infected cells. Moreover, hCMV infection activates numerous host genes many of which encode pro-inflammatory proteins. However, little is known about the relative contributions of individual viral gene products to these changes in cellular transcription. We systematically analyzed the effects of the hCMV 72-kDa immediate-early 1 (IE1) protein, a major transcriptional activator and antagonist of type I interferon (IFN) signaling, on the human transcriptome. Following expression under conditions closely mimicking the situation during productive infection, IE1 elicits a global type II IFN-like host cell response. This response is dominated by the selective up-regulation of immune stimulatory genes normally controlled by IFN-γ and includes the synthesis and secretion of pro-inflammatory chemokines. IE1-mediated induction of IFN-stimulated genes strictly depends on tyrosine-phosphorylated signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) and correlates with the nuclear accumulation and sequence-specific binding of STAT1 to IFN-γ-responsive promoters. However, neither synthesis nor secretion of IFN-γ or other IFNs seems to be required for the IE1-dependent effects on cellular gene expression. Our results demonstrate that a single hCMV protein can trigger a pro-inflammatory host transcriptional response via an unexpected STAT1-dependent but IFN-independent mechanism and identify IE1 as a candidate determinant of hCMV pathogenicity

Analysen zum Einfluss spezifischer Kapsidmutationen auf den CypA-abhängiggen Replikationsphänotyp von HIV-1

Eine effektive, HIV-spezifische Immunantwort durch zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) kann ein Grund dafür sein, dass eine HIV-infizierte Person eine verlängerte oder sogar andauernde Kontrolle der HIV-Infektion erlangt 1. Die exprimierten humanen Leukozyten-antigene (HLA) spielen hierbei eine entscheidende Rolle. Vor allem die HLA-B Gene B*27 und B*57 sind wiederholt als protektiv im Fall einer HIV-Infektion beschrieben worden 2–5. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss verschiedener Punktmutationen auf die virale Replikationskompetenz. Die untersuchten Mutationen sind zum Teil in vivo und/oder in vitro mit dem CTL-Immunselektionsdruck auf zwei immunodominate p24/Gag-Epitope, TW10 (Aminosäuren 241-250) und KK10 (Aminosäuren 263-272) assoziiert 6,7. Durch Mutagenese wurden provirale Varianten des HIV-Laborstamms NL4-3 generiert und in HEK293T-Zellen transfiziert. Mit den so generierten Viren erfolgte die Infektion einer Reporter-T-Zelllinie. Die Infektiosität der Virusvarianten im Vergleich zum WT wurde anschließend mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Die Mutation R264K im KK10-Epitop von p24 des HIV-1 macht das Virus in vitro nahezu replikationsinkompetent. In Patientenisolaten (in vivo) findet sich die Mutation R264K deshalb fast ausschließlich in der Gegenwart der kompensatorisch wirkenden („sekundären“) Mutation S173A. Die Interaktion von Cyclophilin A (CypA) mit dem viralen Kapsidprotein p24 spielt bei dem beschriebenen Phänotyp eine wichtige Rolle. Wildtyp HIV-1 und die kompensierte Variante sind in vitro CypA-abhängig, wohingegen die R264K-Variante auf eine Inhibierung der CypA/p24 Interaktion, beispielsweise durch Cyclosporin A (CsA), angewiesen ist (CsA-abhängiger Phänotyp).7 Neben R264K sind drei weitere Gag-Mutationen beschrieben, die eine CsA-Abhängigkeit vermitteln: T186A, A224E und G226D 8–10. In dieser Arbeit wurden vier wichtige Erkenntnisse erzielt: 1) Alle als CsA-abhängig bekannten Varianten wurden in vitro durch die in vivo relevante Mutation S173A kompensiert („universeller Kompensator“). In eingeschränktem Maß gilt dies ebenfalls für die sekundären in vitro Mutationen V218A und A237T. Dies demonstriert, dass es sich bei T186A, A224E, G226D und R264K nicht nur um mehrere zu einem ähnlichen Phänotyp führende Mutationen handelt, sondern dass diese Mutationen den gleichen molekularen Mechanismus beeinträchtigen. 2) Es wurden mehrere, noch nicht beschriebene, kompensatorisch wirksame in vitro Mutationen für die R264K-Variante identifiziert, die in vitro in ihrer Wirkung mit der S173A Mutation vergleichbar sind. 3) Computergestützte Berechnungen einzelner Kapsidvarianten lieferten keine Anhaltspunkte dafür, dass die untersuchten Mutationen die Proteinstruktur von p24 verändern und zeigten zudem, dass die wirksamsten der alternativen kompensatorischen Mutationen in der Region der p24 alpha-Helices 2-5 liegen. 4) Im Gegensatz zu den unter 2) beschriebenen alternativen in vitro Mutationen konnte für in vivo Mutationen eines ausgewählten Patientenisolats kaum ein kompensierender Effekt gezeigt werden. Bei den in vivo Mutationen handelt es sich um HLA-B*57 assoziierte Mutationen, die in einigen der seltenen Isolaten gefunden wurden, in denen R264K in vivo ohne die S173A Mutation nachgewiesen werden konnte. Die vorliegende Arbeit liefert neue Erkenntnisse über den Einfluss von Punktmutationen auf die Interaktion von p24 mit dem zellulären HIV-1 Ko-Faktor CypA und legt die Vermutung nahe, dass ein weiteres (zelluläres) Protein an p24 bindet und an der Vermittlung des CypA-abhängigen Phänotyps beteiligt ist. 1. Miura, T. et al. HLA-Associated Alterations in Replication Capacity of Chimeric NL4-3 Viruses Carrying gag-protease from Elite Controllers of Human Immunodeficiency Virus Type 1. J. Virol. 83, 140–149 (2009). 2. Migueles, S. A. et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 2709–2714 (2000). 3. Altfeld, M. et al. Influence of HLA-B57 on clinical presentation and viral control during acute HIV-1 infection. AIDS Lond. Engl. 17, 2581–2591 (2003). 4. Streeck, H. et al. Recognition of a Defined Region within p24 Gag by CD8+ T Cells during Primary Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection in Individuals Expressing Protective HLA Class I Alleles. J. Virol. 81, 7725–7731 (2007). 5. Baker, B., Block, B., Rothchild, A. & Walker, B. Elite control of HIV infection: implications for vaccine design. Expert Opin. Biol. Ther. 9, 55–69 (2009). 6. Brockman, M. A. et al. Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A. J Virol 81, 12608–12618 (2007). 7. Schneidewind, A. et al. Escape from the Dominant HLA-B27-Restricted Cytotoxic T-Lymphocyte Response in Gag Is Associated with a Dramatic Reduction in Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication. J Virol 81, 12382–12393 (2007). 8. Braaten, D. et al. Cyclosporine A-resistant human immunodeficiency virus type 1 mutants demonstrate that Gag encodes the functional target of cyclophilin A. J. Virol. 70, 5170–5176 (1996). 9. Yang, R. & Aiken, C. A Mutation in Alpha Helix 3 of CA Renders Human Immunodeficiency Virus Type 1 Cyclosporin A Resistant and Dependent: Rescue by a Second-Site Substitution in a Distal Region of CA. J. Virol. 81, 3749–3756 (2007). 10. Qi, M., Yang, R. & Aiken, C. Cyclophilin A-Dependent Restriction of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Capsid Mutants for Infection of Nondividing Cells. J. Virol. 82, 12001–12008 (2008)